647偶联试剂盒(尤其适合分子量6-20 KD样本)-LinKine™-AbFluor™

注意：该试剂盒所配纯化柱适用于分子量在 6 KD 到 20 KD 的样本；如有未使用完的试剂，请及时密封保存于-20℃。

自备耗材

• 待标记样本
• 移液器和吸头
• 去离子水
• PBS (PH 7.4)

样本制备

待标记样本的初始浓度应高于 2 mg/mL，建议蛋白浓度达到 2.5 mg/mL 以上效果最佳，否则实验前需进行浓缩以提高浓度。待标记样本的组分（或储存缓冲液）应符合如下要求：

1. (1) 不含有氨基成分，否则会影响偶联效果。
2. (2) 少量 BSA 不会影响偶联效果，但建议使用 PBS 作为缓冲液。
3. (3) 若样本中含有可能干扰标记的物质，建议用 PBS 置换缓冲液，具体方法为：将样本加入超滤管中，加入 150-200 µL PBS，12,000 g、4℃，离心 10 min，弃掉滤液；再次补齐 PBS，12,000 g、4℃、离心 10 min；离心后取出超滤管内芯，倒置于干净外管中，4,000 g，4℃，离心 2 min，收集置换缓冲液后的样本。

待标记样本的缓冲液应满足如下要求：

实验步骤

注意：请根据实际样品量，相应放大或缩小试剂盒各组分在反应体系中的体积。

以下操作步骤是以 3×100 µg 规格为例，其它规格的试剂用量请进行等比调整。如果需要调整体积，请保持样本量不变更改标记体系中 AbFluorTM 647 labeling solution、Activated AbFluorTM 647 solution 和去离子水的体积。

1. 向待标记样本溶液中加入 15 µL AbFluorTM 647 labeling solution，用移液器温和混匀。
2. 吸取 7.5 µL Activated AbFluorTM 647 solution 至步骤 1 反应液中，加去离子水至 150 µL（注：此体积为标记体系），温和混匀，37℃避光静置 1 h。

注意：步骤 1/2 属于标记步骤。

3. 向步骤 2 反应液中加入适量 PBS（定容至约 500 µL），温和混匀，将溶液移至纯化柱，12,000 g、4℃、离心 10 min。
4. 弃滤液，加适量 PBS（定容至约 500 µL）到纯化柱，4℃、12,000 g、离心 10 min。
5. 取出纯化柱倒置于干净离心管中，4℃、4,000 g、离心 2 min，离心管收集到的溶液即为偶联产物。

注意：步骤 3/4/5 属于纯化步骤；偶联物 4℃避光条件下可稳定保存一个月。若需长期储存，请分装并于-20℃下避光保存，避免反复冻融，可加入同体积甘油。

结果计算

1. 偶联物浓度的计算：

其中：C 是指实验收集的偶联物浓度；稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数（详见备注）； A280和 Amax分别是指在 280 nm 处的吸光度以及在最大吸收波长（AbFluorTM 647 的最大吸收波长为 650 nm）处的吸光度；CF 是校正因子，AbFluor™ 647 的 CF 值为 0.03；1.4 则是指 IgG（mL/mg）的消光系数，AbFluor™ 647 的消光系数为 240,000。

2. 偶联物标记程度（degree of labeling, DOL）的计算:

其中：Amax 指在最大吸收波长处的吸光度（AbFluor™ 647 的最大吸收波长为 650 nm）；稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数； C 是指实验收集的偶联物浓度；Mwt 是指待标记样本的分子量；ε 是荧光染料的消光系数，AbFluor™ 647 的消光系数为 240,000。

注意：过柱洗脱的偶联物直接用于吸光度检测可能浓度过大，因此需要稀释到适当浓度（蛋白测定仪的浓度范围）。稀释倍数（即稀释因子）需要从起始样本质量以及洗脱得到的偶联物的总体积来进行预估，如未经稀释则稀释因子为 1。

常见问题

注意事项

1. 不同批次号、不同的厂家的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
2. 混合或复溶组分时，避免产生气泡。如有未使用完的试剂，请及时密封保存于-20℃。
3. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
4. 保持好的实验习惯，穿戴好手套、实验服、口罩、防目镜等防护工具后再开始实验。