土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 680 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、离心机、30-50目筛
• 去离子水

试剂准备

Reagent I：临用前配制；按 LiquidⅠ：Liquid II：去离子水=90（μL）：20（μL）：21（mL）的比例配制，现配现用。出现白色絮状沉淀则不能用。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 6 mL去离子水，96 T加入 12 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光保存 1个月。

Working Reagent III：临用前配制；48 T加入 2 mL Reagent VI，96 T加入 4 mL Reagent VI，沸水浴中磁力搅拌溶解（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 min，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用），然后 48 T再加入 8 mL Reagent I，96 T再加入 16 mL Reagent I，充分混匀待用。用不完的试剂 4℃避光保存 1个月。

Working Reagent IV：临用前配制；48 T加入 35 mL去离子水，96 T加入 70 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂 4℃避光保存 1个月。

Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：Reagent II 有刺激性气味，Reagent V有毒，建议在通风橱进行实验。

Reagent VI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Stardard：即用型；20 μmol/mL酪氨酸；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

0.4 μmol/mL Standard：临用前配制；取 20 µL Standard，加入 980 µL去离子水，充分混匀，配制成 0.4 μmol/mL Standard。

注意：每次实验都需要制备 0.4 μmol/mL Standard，稀释后的 0.4 μmol/mL Standard需在 4 h内使用完。

样本制备

注意：推荐使用新鲜土壤样本。

新鲜土样自然风干或 37℃烘箱风干，过 30-50目筛。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 680 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中）：

3. 混匀后置于 40℃孵育 20 min，8,000 g，25℃离心 10 min，取 200 μL上清至微量玻璃比色皿或 96孔板中，记录 680 nm处吸光值，空白管记为 A 空白，标准管记为 A 标准，测定管记为 A 测定，对照管记为 A 对照。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：(1) 空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。(2) 如果ΔA 测定小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.8，加入Working Reagent II 后的上清可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

S-ACPT活性的计算：

酶活单位定义：每天每 g土样中产生 1 μmol的酪氨酸为一个酶活力单位。

S-ACPT(U/g 土样)=C 标准×ΔA 测定÷ΔA 标准×V 反总÷W÷T=0.08×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

C 标准：0.4 μmol/mL标准酪氨酸溶液；V 反总：反应体系总体积，0.2 mL；W：样品质量，g；T：反应时间，24 h=1 d。