594偶联试剂盒-LinKine™-AbFluor™

注意：该试剂盒所配纯化柱适用于分子量在 200 KD 到100 KD 的样本；如有未使用完的试剂，请及时密封保存于-20℃。

自备耗材

• 待标记样本
• 移液器和吸头
• 去离子水
• PBS (PH 7.4)

样本制备

待标记样本的初始浓度应高于 2 mg/mL，建议蛋白浓度达到2.5 mg/mL 以上效果最佳，否则实验前需进行浓缩以提高浓度。待标记样本的组分（或储存缓冲液）应符合如下要求：

1. (1) 不含有氨基成分，否则会影响偶联效果。
2. (2) 少量 BSA不会影响偶联效果，但建议使用 PBS作为缓冲液。
3. (3) 若样本中含有可能干扰标记的物质，建议用 PBS置换缓冲液，具体方法为：将样本加入超滤管中，加入200-150 µL PBS，12,000 g、4℃，离心 10 min，弃掉滤液；再次补齐 PBS，12,000 g、4℃、离心 10 min；离心后取出超滤管内芯，倒置于干净外管中，4,000 g、4℃、离心 2 min，收集置换缓冲液后的样本。

待标记样本的缓冲液应满足如下要求：

实验步骤

注意：请根据实际样品量，相应放大或缩小试剂盒各组分在反应体系中的体积。

不同规格建议的最适标记样本量和标记体系如下：

以下操作步骤是以 3×100 µg 规格为例，其它规格的试剂用量请进行等比调整。如果需要调整体积，请保持样本量不变更改标记体系中 AbFluorTM 594 labeling solution、Activated AbFluorTM 594 solution 和去离子水的体积。

1. 向待标记样本溶液中加入 15 µL AbFluorTM 594 labeling solution，用移液器温和混匀。
2. 吸取 7.5 µL Activated AbFluorTM 594 solution 至步骤1反应液中，加去离子水至 150 µL（注：此体积为标记体系），温和混匀，37℃避光静置 1 h

注意：步骤1/2属于标记步骤。

3. 向步骤2反应液中加入适量 PBS（定容至约 500 µL），温和混匀，将溶液移至纯化柱，12,000 g、4℃、离心 10 min。
4. 弃滤液，加适量 PBS（定容至约 500 µL）到纯化柱，4℃、12,000 g、离心 10 min。
5. 取出纯化柱倒置于干净离心管中，4℃、4,000 g、离心 2 min，离心管收集到的溶液即为偶联产物。

注意：步骤3/4/5属于纯化步骤；偶联物避光条件下可稳定保存一个月。若需长期储存，请分装并于 -20℃下避光保存，避免反复冻融，可加入同体积甘油。

结果计算

1. 偶联物浓度的计算：

C (mg/mL) = {[A280-(Amax×CF)]/1.4}×稀释因子

其中：C 是指实验收集的偶联物浓度；稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数（详见备注）；A280 和 Amax 分别是指在 280 nm 处的吸光度以及在最大吸收波长（AbFluorTM 594 的最大吸收波长为 593 nm）处的吸光度；CF 是校正因子，AbFluorTM 594 的 CF 值为 0.08；1.4 则是指 IgG (mL/mg) 的消光系数，AbFluorTM 594 的消光系数为 115,000。

2. 偶联物标记程度（degree of labeling, DOL）的计算：

DOL = (Amax × Mwt × 稀释因子)/(ε × C)

其中：Amax指在最大吸收波长处的吸光度（AbFluorTM 594 的最大吸收波长为 593 nm）；稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数；C 是指实验收集的偶联物浓度；Mwt 是指待标记样本的分子量；ε 是荧光染料的消光系数，AbFluorTM 594 的消光系数为 115,000。

注意：过柱洗脱的偶联物直接用于吸光度检测可能浓度过大，因此需要稀释到适当浓度（蛋白测定仪的浓度范围）。稀释倍数（即稀释因子）需要从起始样本质量以及洗脱得到的偶联物的总体积来进行预估，如未经稀释则稀释因子为 1。

注意事项

常见问题解答

1. 问：浓缩后样本浓度仍低于 2 mg/mL？

答：如果浓缩后样本浓度仍小于 2 mg/mL 可适当调整标记体系的体积，但最终浓度应大于 1 mg/mL。步骤1中 AbFluorTM 594 labeling solution 的体积应为标记体系体积的 10%，步骤2中可不添加去离子水，Activated AbFluorTM 594 solution的体积保持不变，您也可以根据自己实验进行适当调整。

2. 问：待标记样本分子量大小不同，如何选择合适的纯化柱？

答：本产品配备的超滤管适用于分子量为 200 KD-100 KD 的样本。若您需要偶联的样本分子量大于 200 KD 或小于 100 KD，为保证偶联最佳效果，需另行配备大小合适的超滤管。

3. 问：待标记样本分子量与 AbFluorTM 594 相近？

答：如果样本分子量与 AbFluorTM 594 相近，可在进行完此说明书对应的标记步骤后加入 30 µL 0.5 µM NH4 Cl，37℃下孵育 10 min 以淬灭游离的 AbFluorTM 594，无须进行此说明书对应的纯化步骤。

4. 问：AbFluorTM系列荧光染料的相关参数？

答：详见如下表格：

名称	最大激发光/发射光 (nm)	消光系数 (ε)	校正因子 (Cf)	分子量 (Da)
AbFluor ™ 488	490/515	70,000	0.1	~834
AbFluor ™ 555	555/565	150,000	0.08	~1077
AbFluor ™ 594	593/614	115,000	0.08	~927
AbFluor ™ 647	650/665	240,000	0.03	~1258
AbFluor ™ 680	680/701	140,000	0.32	~1111

注意事项

1. 不同批次号、不同的厂家的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
2. 混合或复溶组分时，避免产生气泡。如有未使用完的试剂，请及时密封保存于 -20℃。
3. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
4. 保持好的实验习惯，穿戴好手套、实验服、口罩、防目镜等防护工具后再开始实验。