小鼠趋化因子16 ELISA定量试剂盒-EliKine™

自备耗材

• 酶标仪（能测450 nm处的吸光度）
• 多通道移液器或自动洗板机
• 恒温箱、低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水

试剂准备

Standard Diluent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Standard Diluent用于稀释标准品。

1×Assay Buffer：使用前，平衡到室温，用去离子水按1:10的比例稀释Assay Buffer (10×)得到1×Assay buffer，轻轻混合以避免起泡。4℃保存，此溶液可稳定保存30天。1×Assay buffer用于稀释血清和血浆样品，Mouse CXCL16 Detect Antibody (100×)和Streptavidin-HRP (100×)。

Mouse CXCL16 Standard：加入标准品的标签上标注重悬体积的去离子水复溶Mouse CXCL16 Standard得到160 pg/mL标准品。在进行稀释之前，将标准品至少放置15 min并轻轻晃动，复溶后Standard可在-20℃保存1个月，重溶使用1次后丢弃。

1×Mouse CXCL16 Detect Antibody：稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用1×Assay buffer对Mouse CXCL16 Detect Antibody（100×）进行1:100稀释。1×Mouse CXCL16 Detect Antibody应在稀释后30 min内使用。

1×Streptavidin-HRP：稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用1×Assay buffer对Streptavidin-HRP（100×）进行1:100稀释。1×Streptavidin-HRP应在30 min内使用。

HRP Substrate（TMB）：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Stop Solution：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

1×Wash Buffer：使用前平衡到室温，用去离子水进行1:20稀释得到1×Wash buffer。轻轻混合以避免起泡，室温保存，此溶液可稳定保存30天。

标准曲线设置

按下表所示，用Standard Diluent将160 pg/mL标准品稀释为80、40、20、10、5、2.5、1.25和0 pg/mL的Mouse CXCL16标准品。

注意：每次实验都需要新配制标准品。

样本制备

1. 细胞培养上清：离心除去颗粒，立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
2. 血清：使用血清分离管，让样品在室温下凝结30 min，然后1,000 g离心15 min。取上层血清立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
3. 血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆。在收集后30 min内1,000 g离心15 min。立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

正常血清血浆样本需要100倍稀释。推荐5 μL样本+495 μL 1×Assay Buffer。

注意：不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在24 h内使用，则可以将其储存在2至8℃，避免反复冻融。测定前，应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。

实验步骤

1. 从板框上取下多余的板条，将它们放回装有干燥剂包的铝箔袋中，然后重新密封。
2. 除去每孔中的液体并洗涤。使用多通道移液器或自动清洗机每孔加入300 μL 1×Wash buffer静置浸泡30 s，进行洗涤。在每个步骤中完全去除液体对于获得良好性能至关重要。最后一次洗涤后，倒置酶标板并用干净的纸巾吸干以除去任何剩余的1×Wash buffer。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。
3. 加标准品：标准品孔加入100 μL稀释的标准品。
4. 加样品：血清/血浆：样本孔加入100 μL预稀释样本。细胞培养上清：样本孔加入100 μL细胞培养上清。
5. 加检抗：每孔加入50 μL 1×Mouse CXCL16 Detect Antibody，保证步骤3、4、5连续加样，不要间断。加样过程在15 min内完成。给酶标板覆膜，在室温下孵育2 h。
6. 重复步骤2中的洗涤6次。
7. 每孔加入100 μL 1×Streptavidin-HRP。给酶标板覆膜，在室温下孵育45 min，注意避光。
8. 按照步骤3重复洗涤过程6次。
9. 每孔加入100 μL HRP Substrate（TMB）。给酶标板覆膜，并在室温下避光孵育5-30 min。
10. 每孔加入100 μL Stop Solution，Stop Solution应按照与TMB相同的顺序加到板中。孔中的颜色应从蓝色变为黄色。如果孔中的颜色为绿色或颜色变化不均匀，请轻轻敲击板以确保彻底混合。
11. 在30 min内，测定每孔450 nm处的吸光值。

注意：5-30 min显色时间为经验范围，每个具体的实验，可根据以下情况，确定大致的显色时间：

• 肉眼观察：标曲S5孔有淡蓝色、Blank孔无明显蓝色时，即可终止；
• 仪器判断：630 nm左右波长下，标曲S1孔的OD值达到0.5-0.7、S5孔的OD值达到0.05-0.08、Blank孔的OD值小于0.05时，即可终止。

结果计算

1. 计算每个标准品和样品的复孔平均OD值，并减去零浓度（Std.8）平均OD值。
2. 标准曲线的绘制：以标准品浓度为x轴，各标准品的平均吸光度为y轴，绘制标准曲线。可以使用作图软件来创建标准曲线。

注意：如果样品被稀释，从标准曲线读取的浓度必须乘以稀释系数。