人/小鼠/大鼠转化生长因子β2 ELISA定量试剂盒-EliKine™

自备耗材

• 酶标仪（能测 450 nm处的吸光度）
• 多通道移液器或自动洗板机
• 恒温箱、低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 盐酸、氢氧化钠
• 去离子水

试剂准备

Standard Diluent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Standard Diluent用于稀释标准品。

1×Assay Buffer：使用前，平衡到室温，用去离子水按 1:10的比例稀释 Assay Buffer (10×)得到 1×Assay buffer，轻轻混合以避免起泡。4℃保存，此溶液可稳定保存 30 天。1×Assay buffer 用于稀释血清和血浆样品，TGF-β2 Detect Antibody (100×)和 Streptavidin-HRP (100×)。

TGF-β2 Standard: 加入标准品的标签上标注重悬体积的去离子水复溶 TGF-β2 Standard得到 4,000 pg/mL标准品。在进行稀释之前，将标准品至少放置 15 min并轻轻晃动，复溶后 Standard可在-20℃保存 1个月，重溶使用 1次后丢弃。

1×TGF-β2 Detect Antibody： 稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用 1×Assay buffer对 TGF-β2 Detect Antibody（100×）进行 1:100 稀释。1×TGF-β2 Detect Antibody应在稀释后 30 min内使用。

1×Streptavidin-HRP：稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用 1×Assay buffer对 Streptavidin-HRP（100×）进行 1:100稀释。1×Streptavidin-HRP应在 30 min内使用。

HRP Substrate (TMB)：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Stop Solution：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

1×Wash Buffer: 使用前平衡到室温，用去离子水进行 1:20 稀释得到 1×Wash buffer。 轻轻混合以避免起泡，室温保存，此溶液可稳定保存 30天。

标准曲线设置

按下表所示，用 Standard Diluent将 4,000 pg/mL标准品稀释为 2,000、1,000、500、 250、125、62.5、31.25和 0 pg/mL 的 TGF-β2标准品。

注意：每次实验都需要新配制标准品。

样本制备

1. 细胞培养上清：

离心除去颗粒，立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。培养液中的动物血清可能含有高水平的 TGF-β2前体，因此需要通过对照来确定培养液中 TGF-β2的背景浓度。

2. 尿液：

无菌收集晨尿中段，1,000 g 离心 10 min除杂立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

3. 血清：

使用血清分离管，让样品在室温下凝结 30 min，然后 1,000 g 离心 15 min。 取上层血清立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

4. 血浆：

使用 EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆。在收集后 30 min内 1,000 g离心 15 min。立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

样本活化

生物样品中的 TGF-β2通常以无活性的形式存在，在检测 TGF-β2活性前样本必须用酸活化碱中和处理（标准品除外），具体活化步骤如下。

1. 酸活化：

60 μL样本+30 μL 1N HCl，混匀，室温孵育 10min。

2. 碱中和：

加入 30 μL 1N NaOH，混匀。

3. 细胞培养上清、尿液样本：

每 60 μL样本+30 μL 1N HCl，混匀，室温孵育 10min，然后加入 30 μL 1N NaOH 进行中和。混合均匀后须立即检测。

4. 血清、血浆样本：

每 60 μL样本+30 μL 1N HCl，混匀，室温孵育 10min，然后加入 30 μL 1N NaOH 进行中和。混合均匀后须立即检测。

注意：不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在 24 h内使用，则可以将其储存在 2至 8℃，避免反复冻融。测定前，应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。活化后的样本需立即检测，样本在活化后须乘以稀释因子 2。如果样本的 OD值超过标准曲线的最高浓度，须用 1×Assay Buffer稀释活化的样本后再次检测。

实验步骤

1.

从板框上取下多余的板条，将它们放回装有干燥剂包的铝箔袋中，然后重新密封。

2.

除去每孔中的液体并洗涤。使用多通道移液器或自动清洗机每孔加入 300 μL 1×Wash buffer静置浸泡 30 s，进行洗涤。在每个步骤中完全去除液体对于获得良好性能至关重要。最后一次洗涤后，倒置酶标板并用干净的纸巾吸干以除去任何剩余的 1×Wash buffer。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。

3.

加标准品：标准品孔加入 100 μL稀释的标准品。

4.

加样品：血清/血浆：样本孔加入 80 μL 1×Assay Buffer和 20 μL活化样本；细胞培养上清/尿液：样本孔加入 100 μL活化样本（详见样本制备）。

5.

加检抗：每孔加入 50 μL 1×TGF-β2 Detect Antibody，保证步骤 3、4、5连续加样，不要间断。加样过程在 15 min内完成。给酶标板覆膜，在室温下孵育 2 h。

6.

重复步骤 2中的洗涤 6次。

7.

每孔加入 100 μL 1×Streptavidin-HRP。给酶标板覆膜，在室温下孵育 45 min，注意避光。

8.

按照步骤 3重复洗涤过程 6次。

9.

每孔加入 100 μL HRP Substrate (TMB)。给酶标板覆膜，并在室温下避光孵育 5-30 min。

10.

每孔加入 100 μL Stop Solution，Stop Solution应按照与 TMB 相同的顺序加到板中。孔中的颜色应从蓝色变为黄色。如果孔中的颜色为绿色或颜色变化不均匀，请轻轻敲击板以确保彻底混合。

11.

在 30 min内，测定每孔 450 nm处的吸光值。

注意：5-30 min显色时间为经验范围，每个具体的实验，可根据以下情况，确定大致的显色时间。

1) 肉眼观察：标曲 S5孔有淡蓝色、Blank孔无明显蓝色时，即可终止；

2) 仪器判断：630 nm左右波长下，标曲 S1孔的 OD值达到 0.5-0.7、S5孔的 OD值达到 0.05-0.08、Blank孔的 OD值小于 0.05时，即可终止。

结果计算

1.

计算每个标准品和样品的复孔平均 OD值，并减去零浓度（Std.8）平均 OD值。

2.

标准曲线的绘制：以标准品浓度为 x轴，各标准品的平均吸光度为 y轴，绘制标准曲线。可以使用作图软件来创建标准曲线。如果血清/血浆样本按照说明书进行稀释，最终的稀释倍数为 10，细胞上清/尿液样本按照说明书进行稀释，最终的稀释倍数为 2。如果样本进行了其它方式的稀释，计算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。