硝酸还原酶(NR)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 540 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Inducer Stock Solution：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃保存。
• ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃避光保存。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温，如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用。4℃保存。
• Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
• Standard：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃保存。
• Inducer Working Solution：临用前配制；根据实验用量，将 Inducer Stock Solution稀释 10倍，即取 1 mL Inducer Stock Solution加 9 mL去离子水，充分混匀，现用现配。
• Diluted Standard：临用前配制；将 Standard稀释 100倍，即取 0.1 mL Standard加 9.9 mL去离子水，充分混匀。-20℃分装可保存 2周。

样本制备

1. 植物组织：

1. 样本诱导：将新鲜标本洗净并用滤纸吸干，放入盛有 Inducer Working Solution的烧杯中（淹没样本即可），浸泡 2 h，取出样本，用滤纸吸干。
2. 样本提取：称取 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，进行冰浴匀浆。8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。

注意：建议使用新鲜没有冷冻过的样本。一般不要诱导处理，预测定结果没有活性（A 测定≤A 对照）则需要诱导处理。

2. 细菌或细胞：

收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 540 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

混匀，25℃显色 20 min，于 540 nm处测定光吸收值，测定孔、对照孔、标准孔和空白孔分别记为 A 测定、A 对照、A 标准和 A 空白。

计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：标准孔和空白孔只要测一次，每个测定孔设一个对照孔。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 1.0，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生 1 μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。

（2）按样品质量计算：

单位定义：每小时每 g新鲜样本催化产生 1 μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。

（3）按细菌或细胞数量计算：

单位定义：每小时每 104个细菌或细胞催化产生 1 μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。

C 标准：标准孔浓度，0.1 μmol/mL；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，0.5 h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞数量，万。