山梨醇(Sorbol)含量测定试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 655 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Standard：临用前配制；加入 1 mL去离子水配制成 10 mg/mL的山梨醇标准品备用，4℃避光可保存 2周。

标准品制备

使用 10 mg/mL的山梨醇标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL 去离子水，研磨成匀浆，95℃水浴 10 min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，8,000g，常温离心 10 min，取上清液待测。
2. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 655 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中操作）：

混匀后，室温静置 15 min，8,000 g，常温离心 10 min，取 200 μL上清液至微量玻璃比色皿或 96孔板中，测定 655 nm处吸光度，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定。计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：标准曲线和空白孔只用测 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 4 mg/mL的ΔA 标准，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制：以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x(mg/mL)。
2. 山梨醇含量的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

山梨醇(mg/mg prot)=y×V 样本÷(V 样本×Cpr)=y÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

山梨醇(mg/g 鲜重)=y×V 样本÷(W×V 样本÷V 水)=y÷W

（3）按样本体积计算：

山梨醇(mg/mL)=x×n

V 样本：加入样本体积，0.23 mL；V 水：加入去离子水体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：血清等液体样本稀释倍数

注意事项

实验步骤中操作过程不能产生沉淀，可以边加样边混匀或者改变加样顺序。