酰基转移酶(AAT)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 412 nm 处的吸光度）
• 96 孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 无水乙醇
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Receptor：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂盒组分

Substrate：临用前 96 T 加入 21.6 mL Receptor，48 T 加入 10.8 mL Receptor，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存一周，禁止反复冻融。

Chromogen：临用前 96 T 加入无水乙醇 1.2 mL，48 T 加入无水乙醇 0.6 mL，充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存两周。

工作液的配制：每孔配制 190 µL 工作液：吸取 180 µL 溶解后的 Substrate，10 µL Chromogen。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer 捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500 万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS 清洗，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）等液体样本：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 412 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 恒温箱预热到 37℃，工作液置于恒温箱中预热 15 min。
3. 在 96 孔板或微量玻璃比色皿中依次加入 10 μL 样本或 Extraction Buffer，190 μL 工作液，迅速混匀，37℃孵育 2 min，测定 412 nm 处吸光值。样本的吸光值为 A 测，Extraction Buffer 的吸光值为 A 空，计算 ΔA 测=A 测-A 空。

结果计算

A. 使用 96 孔板测定的计算公式

1. 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每 mg 蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

2. 按照样本质量计算

活性单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

3. 按细胞或细菌数量计算

活性单位定义：每 10⁴个细胞或细菌每分钟催化产生 1 nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

4. 按液体体积计算

活性单位定义：每 mL 样本每分钟催化产生 1 nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

ε：TNB 摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，L，200 μL=2×10^-4 L；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V 样：加入上清液体积，0.01 mL；T：反应时间，2 min；n：样本稀释倍数；

W：样品质量，g；V 样总：提取液体积，1 mL；500：细胞或细菌总数，500 万。

B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。