乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm 处的吸光度）
• 96 孔 UV 板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机、水浴锅
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存；内含不溶物，摇匀后使用，用于对照样本时需离心。

试剂盒组分

Working Solution：临用前配置，将 ReagentⅡ全部加入 ReagentⅢ中，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃避光保存，禁止反复冻融。

ReagentⅣ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴匀浆，16,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌：收集 500 万细菌到离心管内，用冷 PBS 清洗，离心后弃上清，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 16,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Working Solution 于室温（25℃）孵育 30 min。
3. 操作表（下述操作在 96 孔 UV 板或微量石英比色皿中操作）：

4. 迅速混匀后，于 340 nm 检测，记录 20 s 和 1 min 20 s 的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算 ΔA 测=(A 测1-A 测 2)-(A 空 1-A 空 2)。

结果计算

A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式

1. 血清（浆）ADH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ADH (U/mL)=3,215×ΔA 测

2. 组织中 ADH 活力的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ADH (U/mg prot)=3,215×ΔA 测÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ADH (U/g 鲜重)=3,215×ΔA 测÷W

3. 按细菌密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ADH (U/10⁴ cells)=6.43×ΔA 测

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=2×10^-4 L；VReagentⅠ：加入 ReagentⅠ体积，1 mL；V 样本：加入样本体积，0.02 mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔 UV 板直径，0.5 cm；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；500：细菌总数，500 万；10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹ nmol。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。