LPO脂质过氧化物含量检测实验方案：组织、细胞与血清样本的操作流程
照着说明书把实验做一遍并不算难。真正容易出问题的，往往发生在实验开始之前：
结果准备按什么单位报告？一批样本到底要配多少管？哪些步骤可以穿插进行？
这些问题如果没有提前算清楚，做到一半才发现样本不够、试剂少配了，或者标准品已经放得太久，就只能返工。
下面以亚科因 LPO脂质过氧化物含量检测试剂盒（微量法，货号 KTB1051）为例，不按试剂盒组分顺序讲，而是按照一次实验真正的推进顺序，把样本准备、管数计算、实验安排和数据处理逐步拆开。
标准品配制、样本前处理和加样表统一放在文末，实验时可以直接对照。
一、实验开始前，先确定3件事
1. 先确定你测的是什么样本
不同样本的前处理方法和可用体积不同。
| 样本 | 提取液 | 取样与提取量 | 上清理论上最多可做的反应数 |
|---|---|---|---|
| 动植物组织 | Extraction Buffer Ⅰ | 约0.1 g样本 + 1 mL | 1 mL ÷ 100 µL = 10个 |
| 细胞 | Extraction Buffer Ⅱ | 5×10⁶个细胞 + 0.4 mL | 0.4 mL ÷ 100 µL = 4个 |
| 血清（浆）等液体 | 不需要提取 | 直接检测 | 取决于样本量 |
每个反应需要加入 100 µL样本，所以提取后的可用体积，直接决定一份样本最多能安排多少个反应。
不过，表中的数字只是理论上限。
实际吸取上清时需要避开底部沉淀，同时还会有一定移液损耗，因此真正能用的上清通常会少一些。
细胞样本尤其要提前算好。0.4 mL提取液理论上可以满足4个反应，但实际实验建议按3个反应左右规划，不要把体积卡得过满。
如果还准备从同一批样本中留一部分做蛋白定量，那么在细胞裂解之前，就要把细胞数量和后续用途一起安排好。
2. 再确定结果按什么单位报告
这一点不要等实验做完以后再想。
因为不同的结果单位，对应需要提前记录的数据也不一样。
| 想报告的单位 | 需要额外记录或测定的数据 | 公式 |
|---|---|---|
| nmol/mg prot | 样本蛋白浓度Cpr（mg/mL），可使用亚科因KTD3001 BCA蛋白定量试剂盒测定 | y ÷ Cpr × n |
| nmol/g | 称取的样本质量W（g） | y ÷ W × n |
| nmol/10⁴个细胞 | 细胞数量N（以10⁴为单位，例如5×10⁶个细胞，N=500） | 0.4y ÷ N × n |
| nmol/mL | 无 | y × n |
其中：
y：样本代入标准曲线后得到的浓度，单位nmol/mL；
n：样本稀释倍数。
这里最容易漏掉两件事。
第一，组织质量必须在匀浆前称好，细胞数量必须在裂解前数好。
这些原始数据一旦没有记录，样本已经处理完以后很难再补。
第二，上面的简化公式建立在KTB1051产品说明书规定的处理体积上：
样本加入体积：0.1 mL；
组织提取液：1 mL；
细胞提取液：0.4 mL。
如果实际实验改变了这些体积，就不能直接套用简化公式，需要按照KTB1051产品说明书中的推导公式重新计算，或咨询技术支持。
如果最终希望把细胞结果换算成 nmol/10⁶个细胞，可将nmol/10⁴个细胞的结果乘以100。
3. 正式上样前，要不要先做预实验？
建议做。
KTB1051产品说明书建议先选择2–3个预期差异较大的样本进行预实验。
目的很直接：先看看样本读数大致落在哪个范围。
如果测定管的ΔA：
小于0.004：需要考虑增加样本量；
大于1.5：需要进一步稀释样本提取液。
这两种情况都意味着要重新配管并重新反应。
如果在正式实验做到一半才发现，返工成本会比较高；提前用少量样本摸清范围，反而更省时间。
二、一批实验到底要配多少管？
可以先用一个简单公式计算：
总管数 = 样本数 × 每个样本的复孔数 + 标准管 + 空白管 + 对照管
其中，标准管按照8个浓度点分别配制。
空白管、对照管和标准管是整批实验共用的，一般每次实验各做1–2次即可，不需要给每个样本单独配一套。
每管需要多少试剂？
每个反应管最终总体积为 500 µL：
样本、标准品、去离子水或无水乙醇：100 µL
Reagent Ⅰ：300 µL
Working Reagent Ⅱ：100 µL
因此整批试剂需要量为：
Reagent Ⅰ：300 µL × 总管数
Working Reagent Ⅱ：100 µL × 总管数
举个例子
假设有12个样本，每个样本做3个复孔，同时设置8个标准浓度点、1个空白管和1个对照管。
| 项目 | 计算 | 结果 |
|---|---|---|
| 总管数 | 12 × 3 + 8 + 1 + 1 | 46管 |
| Reagent Ⅰ | 46 × 300 µL | 13.8 mL |
| Working Reagent Ⅱ | 46 × 100 µL | 4.6 mL |
| 每个样本的用量 | 3 × 100 µL | 300 µL |
Working Reagent Ⅱ配制时，每瓶Reagent Ⅱ加入 12 mL去离子水溶解。
这个例子只是演示计算方法。正式实验时，需要根据自己的样本数和复孔数重新计算，预实验消耗的试剂也要单独考虑。
三、实验当天怎么排顺序？
LPO实验里有几个比较明确的时间约束：
Working Reagent Ⅱ需要临用前配制；
稀释后的标准品需要在4小时内使用；
酶标仪至少提前预热30分钟；
处理后的样本上清需要放在冰上待测；
95℃水浴本身就需要80分钟。
所以，与其机械地按照KTB1051产品说明书从第一项做到最后一项，不如按照这些步骤之间的依赖关系安排实验。
| 顺序 | 操作 | 时间/条件 | 为什么这样安排 |
|---|---|---|---|
| 1 | 从4℃取出Extraction Buffer Ⅰ、Reagent Ⅰ和Standard，平衡至室温；同时将水浴锅升至95℃ | — | 需要提前达到使用条件 |
| 2 | 配制Working Reagent Ⅱ：每瓶加入12 mL去离子水；难溶时可70℃加热并剧烈振荡，或超声处理；加热后冷却至室温，并检查有无粉剂析出 | 视溶解情况 | 临用前配制，而且助溶后还需要冷却 |
| 3 | 打开酶标仪预热，设置535 nm和600 nm | ≥30 min | 可与样本处理同时进行 |
| 4 | 处理样本，并记录质量、细胞数量等归一化数据 | 见下文 | 加样前必须完成 |
| 5 | 配制标准品，并稀释成8个浓度点 | 稀释后4 h内使用 | 可利用样本离心时间完成 |
| 6 | 加样、充分混匀，盖紧管盖并做好密封 | — | 具体体积见附表C |
| 7 | 95℃水浴 | 80 min | 可利用这段时间准备96孔板和数据记录表 |
| 8 | 自然冷却至室温 | — | — |
| 9 | 8000 g、室温离心 | 10 min | — |
| 10 | 取200 µL上清加入96孔板，分别读取535 nm和600 nm吸光度 | — | 进入数据记录阶段 |
仅样本离心、水浴和反应后再次离心这些固定步骤，加起来就需要约100分钟。
这还没有计算匀浆、超声、加样、冷却和上板所需时间，所以提前把各环节穿插好，实验会顺很多。
95℃水浴时注意密封
高温水浴过程中需要避免液体溅出，同时尽量减少水分散失。
更推荐使用带螺旋口的EP管，并用封口膜进一步密封。
如果使用金属浴，可以采取措施避免管盖在加热过程中弹开。
如果使用普通扣盖EP管，可按照KTB1051产品说明书要求做好管口密封和防爆盖处理。
整个加热过程中应保证管盖状态稳定，避免反应液因蒸发造成体积变化。
做好基本防护
生化检测试剂具有一定刺激性和生物毒性，其中Reagent Ⅱ有毒。
操作时建议按照实验室安全规范，在通风橱或生物安全柜等合适环境中进行，并穿戴实验服、口罩、手套、头套等必要防护用品。
四、读完吸光度以后，数据怎么算？
实验需要分别记录两个波长：
535 nm：A₁
600 nm：A₂
测定管先扣除对照管，标准管先扣除空白管，再用535 nm对应的差值减去600 nm对应的差值，得到最终用于计算的 ΔΔA。
以KTB1051产品说明书中的兔肾示例为例。
样本为 0.156 g兔肾组织，采用96孔板检测。
| 535 nm（A₁） | 600 nm（A₂） | |
|---|---|---|
| 测定管读数 | 0.584 | 0.111 |
| 对照管读数 | 0.041 | 0.040 |
| 扣除对照后 | 0.584 − 0.041 = 0.543 | 0.111 − 0.040 = 0.071 |
| ΔΔA测定 | 0.543 − 0.071 = 0.472 |
标准管采用相同的处理方法：
先分别减去空白管，再计算535 nm差值与600 nm差值之差，得到各浓度标准品对应的ΔΔA。
之后分3步计算。
第一步：建立标准曲线
以：
标准品浓度为y轴
ΔΔA标准为x轴
绘制标准曲线。
建议每次实验重新建立标准曲线。
第二步：算出样本浓度
将样本的ΔΔA测定值代入标准曲线方程，得到样本浓度 y（nmol/mL）。
例如KTB1051产品说明书提供的典型曲线为：
y = 66.332x − 0.2186，R² = 0.9997
样本ΔΔA = 0.472，代入后：
y = 31.09 nmol/mL
第三步：根据最终报告单位换算
以兔肾示例按鲜重计算：
LPO（nmol/g）= 31.09 ÷ 0.156 × 1 ≈ 199.30 nmol/g
其中稀释倍数n = 1。
如果没有自建标准曲线，也可以参考KTB1051产品说明书提供的典型曲线计算，但结果仅供参考。
官网同时提供在线计算器，可进入：
官网 > 技术中心 > 在线计算器
输入相应数据进行计算。
五、读数太高或太低，下一步怎么办？
预实验和正式实验中都要注意测定管的ΔA范围。
| 测定管ΔA | 处理方法 |
|---|---|
| ＜0.004 | 可适当增加样本量 |
| ＞1.5 | 用对应Extraction Buffer进一步稀释样本，结果乘以稀释倍数；或减少提取时的样本量 |
这里有一个容易操作错的地方：
需要稀释的是样本提取液，不是已经完成反应的溶液。
因此，如果发现样本读数过高，稀释后的样本需要重新配管，再重新完成水浴、冷却和离心步骤。
这也是为什么正式实验前做2–3个样本的预实验很有必要。
六、这几个环节最容易出问题
| 环节 | 操作要点 |
|---|---|
| Reagent Ⅱ溶不开，或使用前发现粉剂析出 | 可70℃加热并剧烈振荡，或超声处理；加热后冷却至室温再使用；每次使用前检查是否有粉剂析出 |
| Working Reagent Ⅱ保存 | 配制后4℃避光保存，可稳定1个月 |
| 标准品放置时间 | 稀释后的标准品不稳定，需要在4小时内使用；建议每次实验重新制作标准曲线 |
| 水浴时水分散失 | 管盖需要盖紧，更推荐使用带螺旋口的EP管并缠封口膜 |
| 使用分光光度计检测 | 试剂盒兼容分光光度计，但需要按比例调整检测试剂配制量，可咨询技术支持：400-6800-830 |
| 样本保存 | 推荐使用新鲜样本；不能立即检测时可在−80℃保存1个月；室温解冻需在4小时内完成 |
附表A：标准品怎么配？
首先取 2 µL、4.05 mmol/mL Standard，加入 538 µL无水乙醇稀释，得到 15 µmol/mL Standard。
之后按照下表逐级稀释。
| 序号 | 标准品 | 无水乙醇 | 最终浓度（nmol/mL） |
|---|---|---|---|
| 1 | 4 µL 15 µmol/mL Standard | 746 µL | 80 |
| 2 | 100 µL序号1 | 100 µL | 40 |
| 3 | 100 µL序号2 | 100 µL | 20 |
| 4 | 100 µL序号3 | 100 µL | 10 |
| 5 | 100 µL序号4 | 100 µL | 5 |
| 6 | 100 µL序号5 | 100 µL | 2.5 |
| 7 | 100 µL序号6 | 100 µL | 1.25 |
| 8 | 100 µL序号7 | 100 µL | 0.625 |
这里比较考验移液的是前两步。
2 µL和4 µL本身就是小体积，而无水乙醇又容易挥发，小的移液误差也可能影响整条标准曲线。
操作时可注意：
先用无水乙醇润洗枪头；
吸液和排液动作尽量稳定、放慢；
如果实验室有适合挥发性液体小体积移液的正向排液（活塞式）移液器，可优先考虑。
也可以考虑等比例放大稀释体系，以避开5 µL以下的小体积移液，但这样会增加Standard消耗。调整前建议先向技术支持确认。
附表B：不同样本怎么处理？
| 样本 | 处理方法 |
|---|---|
| 动植物组织 | 称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer Ⅰ，冰浴匀浆；8000 g、4℃离心10 min；取上清置冰上待测 |
| 细胞 | 收集5×10⁶个细胞，用预冷PBS清洗；800 g离心2 min，弃上清；加入0.4 mL Extraction Buffer Ⅱ，冰浴超声破碎5 min；8000 g、4℃离心10 min；取上清置冰上待测 |
| 血清（浆）等液体 | 直接检测 |
细胞超声条件按照KTB1051产品说明书设置：
功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次，全程冰浴。
不同型号超声破碎仪的实际输出和探头条件可能不同。使用其他型号仪器时，可先向技术支持确认对应参数。
附表C：加样表
采用1.5 mL EP管进行反应。
| 试剂 | 测定管（µL） | 对照管（µL） | 空白管（µL） | 标准管（µL） |
|---|---|---|---|---|
| 样本 | 100 | 0 | 0 | 0 |
| Standard（各浓度标准品） | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 去离子水 | 0 | 100 | 0 | 0 |
| 无水乙醇 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| Reagent Ⅰ | 300 | 300 | 300 | 300 |
| Working Reagent Ⅱ | 100 | 100 | 100 | 100 |
常见问题
对照管、空白管和标准管，每个样本都需要单独做吗？
不需要。
它们是整批实验共用的，每次实验各做1–2次即可，不需要每个样本重新配一套。
组织和细胞处理完以后，到底取哪一部分检测？
取离心后的上清。
组织和细胞样本经8000 g、4℃离心10分钟后，取上清并放在冰上待测。
血清（浆）等液体样本不需要这一步，可以直接检测。
95℃水浴结束后，可以直接上板读数吗？
不可以。
需要先自然冷却至室温，再以 8000 g、室温离心10分钟。
之后取 200 µL上清加入96孔板，分别读取535 nm和600 nm吸光度。
每次实验都必须重新做标准曲线吗？
建议重新做。
稀释后的标准品稳定性有限，而且不同实验批次的实际反应条件可能存在差异，所以自建标准曲线更有利于提高结果准确度。
如果确实没有自建标准曲线，也可以使用KTB1051产品说明书提供的典型曲线进行参考计算，但结果仅供参考。
做这套实验，最值得提前算清楚的是什么？
可以归纳成3件事：
先确定结果单位，再根据样本量计算复孔，最后用2–3个样本做预实验。
这样正式实验开始以后，大部分需要临时返工的问题都能提前发现。
本文涉及产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。具体实验条件与操作步骤请以产品随附KTB1051产品说明书为准。
