谷氨酰胺酶(GLS)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 420 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。ReagentⅠ有结晶析出为正常现象，恢复室温后，混匀使用即可。
• Working Reagent II：临用前配制；48 T每瓶 Reagent II 加入 12.5 mL去离子水，96 T每瓶 Reagent II 加入 25 mL去离子水，充分溶解待用。现配现用。
• Reagent III：即用型；室温避光保存。
• Reagent IV：即用型；室温保存。
• Reagent V：即用型；室温保存。
• Reagent VI：即用型；室温避光保存。

注意：Reagent III 有刺激性气味，Reagent IV 有腐蚀性，Reagent VI 有毒，建议在通风橱进行实验。

Standard：临用前配制；每瓶加入 1mL去离子水，充分溶解，即 100 μmol/mL氨标准品；用不完的试剂 4℃保存 1个月。使用 100 μmol/mL氨标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌和细胞：收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴超声波破碎细菌或细胞 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 420 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中操作）：

混匀，37℃孵育 1 h。

混匀，8000 g，25℃离心 10 min；取上清液，在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次进行以下操作：

3. 充分混匀，室温静置 15 min，记录 420 nm处吸光值，空白管记为 A 空白，标准管记为 A 标准，测定管记为 A 测定，对照管记为 A 对照。

计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管、标准管、对照管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.4可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 1,000 noml/mL的ΔA 标准，样本可用 ReagentⅠ进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (nmol/mL)。

2. GLS活性的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟催化谷氨酰胺生成 1 nmol氨定义为一个酶活力单位。

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟催化谷氨酰胺生成 1 nmol氨定义为一个酶活力单位。

（3）按照细菌或细胞数量计算

酶活单位定义：每 104个细菌或细胞每分钟催化谷氨酰胺生成 1 nmol氨定义为一个酶活力单位。

（4）按样本体积计算：

酶活单位定义：每毫升液体每分钟催化谷氨酰胺生成 1 nmol氨为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，1.05 mL；V 样：加入的样本体积，0.025 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，60 min；n：细菌或细胞数量，以万计；W：样本质量，g。