从样本制备到结果计算：NO一氧化氮检测完整实验操作指南
拿到试剂盒，说明书翻开，步骤看起来不复杂。但真正上手做的时候，总有一些地方说明书写得很简略，或者几个步骤之间的逻辑不太清楚，结果卡在某个细节上。
这篇把完整流程从头捋一遍，重点说那些说明书里一笔带过、但实际操作里容易出问题的地方。
注意：本文所有参数（工作液比例、孵育条件、脱蛋白系数等）均基于 Abbkine KTB1400 的配方体系。如果你用的是其他品牌的NO检测试剂盒，请以该产品说明书为准，不要直接套用这里的数值。
做实验之前，先把这几件事确认好
酶标仪要提前预热。 说明书写的是预热30分钟以上，这步不要省。酶标仪冷机状态下读值不稳定，前几个孔的数据会有漂移。预热这段时间正好用来配标准品和工作液。
所有试剂使用前平衡到室温。 Griess Reagent I、Griess Reagent II、VCl₃ Reagent、ZnSO₄都是即用型，从冰箱取出来之后不要直接用，先放到室温平衡。冷的试剂加进去会影响显色反应的效率。
全程避光。 Griess试剂见光会降解，操作过程中尽量不要让试剂长时间暴露在强光下，配好的工作液尤其要注意。
标准品配制：两步稀释，现配现用
标准品配制是两步稀释，很多人第一次做容易搞混。
第一步：取10 µL NaNO₂ Standard（原液浓度1 M），加990 µL PBS（pH 7.4），得到10 mM储备液I。
第二步：取10 µL 10 mM储备液I，加990 µL PBS，得到100 µM储备液II。后续的标准工作液都从这个100 µM储备液稀释出来。
| 标准工作液 | 100 µM储备液II（µL） | PBS（µL） | 终浓度（µM） |
|---|---|---|---|
| S1 | 200 | 0 | 100 |
| S2 | 100 | 100 | 50 |
| S3 | 40 | 160 | 20 |
| S4 | 20 | 180 | 10 |
| S5 | 10 | 190 | 5 |
| S6 | 4 | 196 | 2 |
| S7 | 2 | 198 | 1 |
| 空白 | 0 | 200 | 0 |
稀释后的标准工作液不稳定，必须在4小时内用完，不能留到下次。原液分装之后-20℃保存，每次取一管现配，不要反复冻融。
样本制备：不同样本处理方式不一样
动植物组织和细胞
称取约0.1 g组织，或者收集5×10⁶个细胞，加1 mL PBS（pH 7.4），冰浴匀浆。匀浆之后14000 rpm、4℃离心10分钟，取上清备用。
冰浴这个条件不能省，组织在匀浆过程中会产热，温度升高会加速NO的进一步氧化和降解，影响最终结果。
细菌
5×10⁶个细菌加1 mL PBS，冰浴超声破碎。超声条件：功率200 W，超声3秒、间隔7秒，重复30次，总计约5分钟。之后同样14000 rpm、4℃离心10分钟取上清。
超声参数对细菌破壁效率影响很大，功率不够或者次数不足，PRO出不来，数据会系统性偏低。如果你的菌株壁比较厚（比如某些革兰氏阳性菌），可以适当延长超声时间，但注意全程冰浴控温。
血清、血浆和高蛋白液体样本
这类样本需要脱蛋白之后再检测。流程：
150 µL样本加8 µL ZnSO₄，涡旋混匀，14000 rpm、4℃离心10分钟，取100 µL上清用于检测。
有几个细节：
第一，脱蛋白完成后上清如果还是浑浊的，说明蛋白没有完全沉淀。肝脏、脑组织这类富含脂质和复杂蛋白的样本，ZnSO₄有时候沉淀不彻底，浑浊的上清会干扰540 nm的读值，这种情况可以考虑用超滤管（截留分子量10 kDa）过滤一次，能有效降低背景。
第二，脱蛋白这一步引入了约1.05倍的稀释，计算结果时要乘上这个系数，不然数据会偏低。
尿液、唾液等低蛋白体液
直接取样检测，不需要脱蛋白步骤。
工作液配制和检测体系搭建
工作液按每孔200 µL配制，但建议按204 µL每孔来算，多配一点留出损耗：
- Griess Reagent I：50 µL
- Griess Reagent II：50 µL
- VCl₃ Reagent：104 µL
三个试剂混合即为工作液，现配现用，配好之后尽快用完，不要存放。
检测体系搭建：取100 µL稀释好的标准品或样本，加入200 µL工作液，混匀。每个样本建议至少重复两次。
混匀之后在37℃孵育30分钟。孵育过程中VCl₃完成NO₃⁻到NO₂⁻的还原，Griess试剂完成显色反应，这30分钟不要缩短。
孵育结束后，8000 g离心1分钟去除不溶物，从每个反应管取250 µL转移到96孔板，在540 nm读取吸光度。
有几个操作细节值得单独说
关于培养基：如果你的细胞样本用RPMI 1640培养，收上清之前一定要换掉培养基，换成DMEM、HBSS或者PBS之类的低硝酸盐培养液。RPMI 1640本身含有较高浓度硝酸盐，直接测背景会虚高，实验组和对照组的差异全被掩盖掉。
关于抗氧化剂：如果样本制备过程中用到了β-巯基乙醇、谷胱甘肽、DTT或者半胱氨酸，这些物质会干扰Griess法的显色反应，测出来的结果不可信。提取和裂解步骤里尽量避开这些试剂，实在无法避开的话，需要换其他方法来测NO。
关于VCl₃：VCl₃溶解在强酸溶液里，加进反应体系之后整体偏酸性。对大多数常规样本没有影响，但如果你的样本缓冲能力很弱，或者是某些特殊来源的生物液体，建议先跑一个预实验确认一下。
结果计算
先算ΔA值：
- ΔA标准 = A标准 - A空白
- ΔA测定 = A测定 - A空白
以标准品浓度为x轴，ΔA标准为y轴绘制标准曲线，把ΔA测定代入方程，得到x值（单位µM）。
典型标准曲线公式参考：y = 0.0124x - 0.002，但每次实验要自己做曲线，不能直接套这个数。
算出x之后，根据样本类型选对应的公式：
| 样本类型 | 计算公式 | 单位 |
|---|---|---|
| 按组织质量 | NO = x ÷ W × n | nmol/g |
| 按细胞/细菌数量 | NO = x ÷ 500 × n | nmol/10⁴ |
| 液体样本（脱蛋白处理） | NO = x × 1.05 × n | nmol/mL |
| 液体样本（直接检测） | NO = x × n | nmol/mL |
| 按蛋白浓度 | NO = x ÷ Cpr × n | nmol/mg prot |
变量说明：W = 样本质量（g）；n = 样本稀释倍数；Cpr = 样本蛋白质浓度（mg/mL）；500 = 细胞或细菌数量5×10⁶以10⁴为单位的换算值。
公式里的变量不多，但含义容易搞混，尤其是n（稀释倍数）。如果你的样本在制备过程中做过稀释，这里要乘进去；如果没有稀释，n = 1。脱蛋白那步引入的1.05倍稀释已经直接写进公式里了，不需要另外乘。
数据出来了，但看起来不对
ΔA测定大于1.0：样本NO含量超出检测上限了。用PBS按2倍、5倍或10倍稀释之后重新检测，计算时乘上对应的稀释倍数。建议在正式实验前先做一组预实验确认稀释比例，避免浪费试剂。
ΔA测定小于0.005：信号太弱，大概率是样本量不够，或者提取步骤有问题。可以适当增加加入反应体系的样本上清体积（同步减少对照液体积保持总量不变）。同时检查一下匀浆或超声是否充分，孵育时间是否足够，EP管在孵育过程中有没有盖紧。
标准曲线线性很差（R²低于0.99）：基本上是标准品配制出了问题，或者某个浓度点操作有误。重新配标准品做一次，每个浓度点单独换吸头，操作过程注意避光。
以上操作流程基于 CheKine™ 一氧化氮（NO）含量检测试剂盒（微量法）（货号：KTB1400）说明书整理，结合实际操作经验补充了部分细节说明。产品咨询：400-6800-830 | 本文内容仅供科研参考，不适用于临床诊断
