乙酸激酶(ACK)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Working ReagentⅡ：临用前配制；取 ReagentⅡ一瓶，加入 11 mL ReagentⅠ和 19.8 μL Reagent III，充分混合溶解，现配现用。-20℃避光可保存一个月。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

样本制备

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，15,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 200 W，超声 3 s，间隔 10 s，重复 30次），然后 15,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 根据实验用量，取出部分配制好的 Reagent II 置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5 min；现配现用。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中进行）：

充分混匀，于 340 nm处测定 10 s的吸光值 A1与 190 s的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACK (U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=1,072×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算:

酶活定义：每 g样品每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACK (U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×W÷V 样总)÷T=1,072×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞密度计算：

酶活定义：每 10⁴个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK (U/10⁴)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.144×ΔA
4. 按液体体积计算:

酶活定义：每mL样本每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACK (U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=1,072×ΔA

ε：NADH微摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；V 样：反应体系中样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，3 min；500：细菌或细胞总数，5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2. 反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，比色皿测定时可取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃去离子水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。