乙醛脱氢酶(ALDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：Extraction Buffer和 Reagent II 有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Working Reagent：临用前配制；根据样本数量，按 Reagent I：Reagent II=200 µL:10 µL的比例混合，充分混匀，现用现配。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 20 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 3 min（功率 300 W，超声 3 s，间隔 7 s，总时间 3 min），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 将Working Reagent在 37℃预热 10 min以上。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中进行）：

充分混匀，于 340 nm处测定初始吸光值 A1，37℃孵育 30 min后于 340 nm处测定吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量或适当延长反应时间（比如反应 60 min）。如果ΔA大于 1.0，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每mg蛋白每分钟催化还原 1 nmol NAD+的酶量为 1个酶活单位。

ALDH (U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T=107.17×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算:

酶活定义：每 g样品每分钟催化还原 1 nmol NAD+的酶量为 1个酶活单位。

ALDH (U/g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)÷T=107.17×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算:

酶活定义：每 104个细胞每分钟催化还原 1 nmol NAD+的酶量为 1个酶活单位。

ALDH (U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×500÷V 样总)÷T=107.17×ΔA÷500

（4）按液体体积计算:

酶活定义：每mL样本每分钟催化还原 1 nmol NAD+的酶量为 1个酶活单位。

ALDH (U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=107.17×ΔA

ε：NADH微摩尔消光系数，6.22×10^-3 L/µmol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，0.2 mL；V 样：反应体系中样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30 min；500：细胞总数，5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

1. Reagent II 有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。