脂蛋白酯酶(LPL)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 400 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、恒温箱、制冰机、离心机、超声破碎仪
• 丙酮
• 研钵或匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 0.6 mL丙酮，96 T加入 1.2 mL丙酮溶解备用，用不完的试剂-20℃避光可以保存 4周。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Standard：5 μmol/mL对硝基苯酚标准溶液，4℃避光保存。

注意：Standard有毒，建议在通风橱进行实验。

标准品制备

使用 5 μmol/mL对硝基苯酚标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Reagent I，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清置冰上待测。
2. 细胞：收集 500万细胞至离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Reagent I，冰浴超声波破碎细胞 3 min（功率 300 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 400 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

混匀，45℃孵育 10 min 无需孵育，继续加入以下试剂

充分混匀，25℃静置 2 min，测定 400 nm处吸光值，分别记为 A 对照、A 测定、A 标准和 A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照、ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：每个测定孔需设一个对照孔，标准曲线和空白孔只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，如果 A 测定小于 0.05可适当加大样本量。如果 A 测定大于 2.0，样本可用 Reagent I 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量，最后计算酶活时对公式进行修改。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制：以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (μmol/mL)。
2. LPL活性的计算：

• （1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：在 45℃，pH 7.5条件下，每 mg蛋白每分钟水解产生 1 nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL(U/mg prot)=x×V 提取÷(V 提取×Cpr)÷T×1,000=100×x÷Cpr
• （2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：在 45℃，pH 7.5条件下，每 g组织每分钟水解产生 1 nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL(U/g 鲜重)=x×V 提取÷W÷T×1,000=100×x÷w
• （3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：在 45℃，pH 7.5条件下，每 104个细胞每分钟水解产生 1 nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL(U/104 cell)=x×V 提取÷500÷T×1,000=0.2×x
• （4）按样本体积计算：

酶活单位定义：在 45℃，pH 7.5条件下，每 mL液体样本每分钟水解产生 1 nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。

LPL(U/mL)=x÷T×1,000=100×x

V 提取：加入 Reagent I 总体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，10 min；1,000：单位换算系数，1 μmol=1,000 nmol；W：样品质量，g；500：细胞总数，5×106。

注意事项

1. 测定孔加入Working Reagent II 后变浑浊为正常现象。