游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 550 nm处的吸光度）
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 匀浆器（如果是组织样本）
• 玻璃瓶（用于配制提取液）
• 正庚烷、无水甲醇、氯仿（三氯甲烷）

试剂准备

Extraction Buffer（自备）：取一个玻璃瓶，按照氯仿:正庚烷:无水甲醇=28:21:1的比例配制，盖紧后混匀，4℃避光保存。

试剂盒组分

Cu Reagent：即用型；使用前，平衡到室温；混匀后使用，4℃避光保存。

Chromogen：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Standard：临用前配制，加 1 mL Extraction Buffer，充分溶解得到 64 mM Standard，未用完的已溶解的 Standard可装于玻璃瓶中盖紧密封，4℃避光保存 1个月。

标准曲线设置

把 64 mM标准品按下表所示，用 Extraction Buffer进行下一步稀释。

注意：每次实验，请使用新稀释的标准品。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 6个月。

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 rpm，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 rpm，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 rpm，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）等液体：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 550 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 样本测定（在 EP管中依次加入下列试剂）：

混匀后盖紧瓶盖，置于涡旋混合器上中速涡旋 30 s

混匀后盖紧瓶盖，置于涡旋混合器上中速涡旋 30 s，室温（25℃）放置 20 min；2,000 g，室温（25℃）离心 5 min

3. 室温（25℃）放置 5 min。每管取出 200 μL加入 96孔板或微量玻璃比色皿对应的孔中，于 550 nm测定吸光值，计算ΔA 测=A 测-A 空、ΔA 标=A 标-A 空（空白管只需做 1管）。显色后务必在 30 min内测完。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，如果 A 测定大于酶标仪检测范围，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制
   以标准液浓度为 y轴，ΔA 标为 x轴绘制标准曲线（浓度为 y轴更方便计算结果）。将ΔA 测带入标准曲线公式计算出 y (mM)。
2. 样本 FFA含量计算

• (1) 按样本质量计算
  FFA含量(μmol/g质量)=y×V 提取÷W×n=y÷W×n
• (2) 按细菌或细胞数量计算
  FFA含量(μmol/104)=y÷(细胞或细菌数量÷V 提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n
• (3) 按液体体积计算
  FFA含量(μmol/L)=1,000×y×n

V 提取：加入提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；n：样本进一步稀释的稀释倍数；500：细菌或细胞总数，500万个；1,000：单位换算系数，1 L=1,000 mL。