过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 580 nm处的吸光度）及水浴锅
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）
• 10 kDa的超滤管或 30% ZnSO4溶液（用来去除蛋白）

试剂盒组分

试剂准备

• Reaction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；整个实验过程中，避光放置；建议分装保存在-20℃避光保存。
• H2O2 Standard (1M)：即用型；使用前，平衡到室温；整个实验过程中，避光放置；建议分装保存在-20℃避光保存。
• Assay Buffer (1×): 使用前，平衡到室温；Assay Buffer (10×)用去离子水 1:10稀释后作为工作液。Assay Buffer (1×)可在 4℃保存至少 2个月，并用来稀释 H2O2标准品和样本。

标准品制备

先配制 2 mM H2O2 Standard：2 μL 1 M的 H2O2 Standard用 998 μL的 Assay Buffer (1×)稀释；再配制 100 μM H2O2 Standard：50 µL 2 mM的 H2O2 Standard用 950 μL的 Assay Buffer (1×)稀释。配制好的标准品需要在 4 h之内使用。100 μM H2O2 Standard，按照下表所示，进一步稀释标准品。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h之内使用；如果样本是细胞悬浮液，建议使用培养基配制 H2O2标准品。

样本制备

1. 动物组织：用冷的 PBS清洗组织，尽可能去除血液。吸干组织上的水分，称取 0.1 g，加入 1 mL预冷的 Assay Buffer (1×)，将样本冰上进行匀浆。10,000 g，4℃离心 5 min，取上清液做进一步分析。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL预冷的 Assay Buffer (1×)捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），10,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞和细菌样本的制备：收集 5×106个细胞或细菌，用冷 PBS 清洗细胞或细菌后，加入 1 mL预冷的 Assay Buffer (1×)冰上进行匀浆或冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次）。10,000 g，4℃离心 5 min，取上清液做进一步分析。
4. 血清、血浆、尿液（和其它生物学液体）：去除蛋白后，取上清。去除蛋白的方式：可使用 10 kDa的超滤管过滤后取滤液或是将样本：30% ZnSO4溶液=20:1进行混合后涡旋，再 10,000 g室温离心 5 min，取上清。

注意：建议使用新鲜样本。如果不能马上进行该项实验，建议将样本储存在-80℃保存 1个月。当准备好进行该项实验时，将样本从-80℃拿出后，冰上解冻，但是请注意，这可能会影响样本的稳定性，实验结果可能会低于预期；如下物质会干扰检测结果，样本中应避免存在：Ferric salts, iron salts, sucrose, glucose, ascorbic acid, SDS (>0.2%), sodium azide。该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1500的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 580 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：

3. 充分混匀，37℃孵育 10 min，读取 580 nm处的吸光值，记为 A 空、A 标、A 测，计算ΔA 标=A 标-A 空、ΔA 测=A 测-A 空。

注意：1. Std.Blank即为空白孔。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。2. 如果ΔA 测大于浓度为 100 µM标准品的ΔA 标，则需要用 Assay Buffer (1×)稀释样本后，重新检测。如果样本的ΔA测低于 0.005，可提高样本量。

结果计算

1. 标准曲线的绘制
   以标准液浓度为 y轴，ΔA 标为 x轴，绘制标准曲线。
2. 样本 H2O2浓度计算
   将ΔA 测代入公式计算出 y (1 µM=1 nmol/mL)。

(1) 按样本鲜重计算
H2O2含量(nmol/g 鲜重)=y×V 样÷(W×V 样÷V 样总) ×n=y÷W×n

(2) 按样本体积计算
H2O2含量(nmol/mL)=y×V 样÷V 样×n=y×n

(3) 按细胞或细菌数量计算
H2O2含量(nmol/104)=y×V 样÷(细胞或细菌数量×V 样÷V 样总)×n=y÷500×n

V 样：加入样本体积，0.06 mL；W：样本质量，g；V 样总：加入 Assay Buffer (1×)体积，1 mL；n：样本稀释倍数；500：细胞或细菌总数，500万。