乙酰胆碱酯酶(AchE)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 412 nm处的吸光度）
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Chromogen：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Substrate：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

工作液的配制：临用前配制；将 Assay Buffer，Chromogen和 Substrate按照 16:1:1的比例混合均匀，现配现用。

试剂盒组分

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 神经细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 新鲜血清（浆）等液体样本：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 412 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 恒温箱预热到 37℃，工作液置于恒温箱中预热 30 min。
3. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入 20 μL样本，180 μL工作液，迅速混匀，37℃孵育 3 min，于 412 nm处测定 3 min内吸光值变化。第 20 s吸光值记为 A1，第 200 s吸光值记为 A2。ΔA=A2-A1。

结果计算

A. 使用 96孔板测定的计算公式

1. 动物组织 AchE活性

(1) 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 的酶量为 1个酶活单位。

(2) 按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 的酶量为 1个酶活单位。

2. 神经细胞 AchE活性

活性单位定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 的酶量为 1个酶活单位。

3. 血清（浆）等液体样本 AchE活性

活性单位定义：每毫升样本每分钟催化产生 1 nmol TNB 的酶量为 1个酶活单位。

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，L，200 μL=2×10^-4 L；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V 样：加入上清液体积，0.02 mL；T：反应时间，3 min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；V 样总：提取液体积，1 mL；500：细胞总数，500万。

B. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。