β-木糖苷酶(β-X)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 405 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 水浴锅、分析天平、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Standard：即用型，5 μmol/mL对硝基苯酚标准溶液；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

标准品制备：5 μmol/mL对硝基苯酚标准溶液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 植物组织：按照组织质量（g）：Reagent I 体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约 0.1g 植物组织，加入 1 mL Reagent I）进行冰浴匀浆，然后 10,000 g，4℃，离心 20 min，取上清待测。

2. 细菌、真菌：按照细菌或真菌数量（104个）：Reagent I 体积（mL）为 500~1000：1的比例（建议 500万细胞加入 1 mL Reagent I），冰浴超声波破碎细胞（功率 300 w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3 min）；然后 10,000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

注意：1. 样本必须全程放置在冰上，否则活性会降低，样本提取完尽快检测。

2. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 405 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

混匀，45℃水浴 20 min

混匀，室温静置 10 min，于 405 nm处测定吸光值，分别记为 A 对照、A 测定、A 标准和 A 空白。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：标准曲线和空白管只需测 1-2次，每个测定管需设一个对照管。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.01可减小稀释倍数或适当加大样本量，如果ΔA 测定大于 0.8，样本可用去 Reagent I 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (μmol/mL)。

2. β-木糖苷酶活性的计算

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：45℃，pH 7.4时每毫克蛋白 1 min内催化产生 1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-X (U/mg prot)=(x×V 样)÷(Cpr×V 样)÷T×1,000=50×x÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：45℃，pH 7.4时每克样品 1 min内催化产生 1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-X (U/g 鲜重)=(x×V 样)÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1,000=50×x÷W

（3）按细菌或真菌数量计算

活性单位定义：45℃，pH 7.4时每 104个细胞 1 min内催化产生 1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-X (U/104)=(x×V 样)÷(N×V 样÷V 样总)÷T×1,000=50×x÷N

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.04 mL；V 样总：加入 Reagent I 体积，1 mL；W：样本质量，g；N：细菌或真菌总数，万；T：反应时间，20 min；1,000: 1 μmol/mL=1,000 nmol/mL。