α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 400 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水
• 研钵或匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent I：临用前配制；每支加入 1.5 mL去离子水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃分装避光可保存 4周，避免反复冻融。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Standard：5 μmol/mL对硝基苯酚标准液，即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

注意：Standard有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

标准品制备

使用 5 μmol/mL对硝基苯酚标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存数周。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

称取约 0.1 g组织样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，15,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：(1) 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

(2) 该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1324、KTB1322、KTB1015的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 400 nm。可见分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

3. 充分混匀，于 400 nm处测定吸光值，分别记为 A 测定、A 对照、A 标准、A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照、ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：每个测定孔需设一个对照孔，标准曲线和空白孔只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA 测定小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 200 nmol/mL的ΔA 标准，样本上清液可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (nmol/mL)。

2. α-GAL活性的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生 1 nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL (U/mg prot)=(x×V 反总)÷(V 样×Cpr)÷T=0.233×x÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟产生 1 nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL (U/g 鲜重)=(x×V 反总)÷(W×V 样÷V 样总)÷T=0.233×x÷W

V 反总：反应体系总体积，0.07 mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30 min。