乙酰辅酶A羧化酶(ACC)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 660 nm 处的吸光度）
• 96 孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL 离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent II：临用前配制；48 T 加入 5 mL ReagentⅠ，96 T 加入 10 mL ReagentⅠ，充分溶解，4℃避光保存可稳定 1 个月。
• Reagent III：临用前配制；48 T 加入 4 mL 去离子水，96 T 加入 8 mL 去离子水，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存 1 个月，避免反复冻融。
• Reagent IV：临用前配制；48 T 加入 5 mL 去离子水，96 T 加入 10 mL 去离子水，充分溶解，4℃避光保存可稳定 1 周。
• Reagent V：临用前配制；48 T 加入 5 mL 去离子水，96 T 加入 10 mL 去离子水，充分溶解，4℃避光保存可稳定 1 周。
• Reagent VI：即用型；室温保存。

注意：Extraction Buffer 有毒且有刺激性气味，Reagent VI 具有腐蚀性，建议在通风橱进行实验。

Working Reagent：按去离子水：Reagent IV：Reagent V：Reagent VI=2：1：1：1 的比例配制，现用现配。

Standard：即用型；10 μmol/mL 标准磷贮备液，使用前，平衡到室温。4℃保存。

0.5 μmol/mL Standard：取 50 μL Standard 加 950 μL 去离子水，充分混匀。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h 之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h 内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌和细胞：收集 500 万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS 清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞 30 次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 660 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 将 ReagentⅠ、II、III 在 37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）预热 10 min。

37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）准确反应 30 min 后，90℃灭活 5 min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10,000 g，25℃离心 5 min，取上清。以下操作在 96 孔板或微量玻璃比色皿中操作：

4. 充分混匀，37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）孵育 30 min 后，冷却至室温，记录 660 nm 处吸光值，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定，对照孔记为 A 对照。计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2 次，每个测定管需要设一个对照管。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.04 可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 1.5，样本可用 Extraction Buffer 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

ACC 活性的计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每小时产生 1 μmol 无机磷的量定义为一个酶活力单位。

ACC(U/mg prot)=10×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每小时产生 1 μmol 无机磷的量定义为一个酶活力单位。

ACC(U/g 鲜重)=10×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

3. 按照细菌或细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴个细菌或细胞每小时产生 1 μmol 无机磷的量定义为一个酶活力单位。

ACC(U/10⁴)=10×ΔA 测定÷ΔA 标准÷n

4. 按样本体积计算：

酶活单位定义：每毫升液体每小时产生 1 μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

ACC(U/mL)=10×ΔA 测定÷ΔA 标准

C 标准：标准溶液的浓度，0.5 μmol/mL；V 反总：反应体系总体积，0.1 mL；V 样：加入的样本体积，0.01 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30 min=0.5 h；n：细菌或细胞数量，以万计；W：样本质量，g。

注意事项

1. 配制 Working Reagent 最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
2. 配好的 Working Reagent 应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染。
3. 显色结束后应立即检测，最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。