丙酮酸脱羧酶(PDC)检测试剂盒(微量法)-CheKine™

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。

ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent：临用前配制，将 ReagentⅢ和 ReagentⅣ用适量 ReagentⅡ溶解后，再全部转移到 ReagentⅡ中备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存一周，避免反复冻融。

ReagentⅤ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer 捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500 万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS 清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. ReagentⅠ25℃水浴提前预热 30 min。
3. 操作表（下述操作在 96 孔 UV 板或微量石英比色皿中操作）：

4. 迅速混匀后于340 nm检测，记录10 s和70 s的吸光值，测定孔的记为A1和A2，空白孔的记为A3和A4，计算ΔA测=(A1-A2)-(A3-A4)。

结果计算

A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式

1. 血清（浆）PDC 活力的计算

单位的定义：25℃中，每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化 1 nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。

2. 组织中 PDC 活力的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中，每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1 nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本质量计算

单位的定义：25℃中，每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1 nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。

3. 细菌或细胞中 PDC 活力的计算

按细菌或细胞数量计算

单位的定义：25℃中，每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1 nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=2×10^-4 L，V 提取：提取液体积，1 mL；V 样本：反应体系中上清液体积，0.02 mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板直径，0.5 cm；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹ nmol。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。

注意事项

1. 提供的 Extraction Buffer 内含不溶物，使用前请摇匀。
2. 如果 1 min 变化值较小，可延长反应时间，同时注意修改计算公式的时间。

结果展示

取 0.1 g 植物叶片加入 1 mL Extraction Buffer 进行匀浆研磨，取上清，之后按照测定步骤操作，用 96 孔 UV 板测得:

A1=1.263，A2=1.236，A3=0.237，A4=0.236，ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)=(1.263-1.236)-(0.237-0.236)=0.026，按样本质量计算酶活得：

PDC (U/g 质量)=3,215×ΔA÷W=3,215×0.026÷0.1=835.9 U/g 质量。

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