磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 水浴锅
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 冷冻离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working ReagentⅡ：临用前配制，用 ReagentⅠ将 ReagentⅡ稀释 10倍，即取 1倍体积的 ReagentⅡ加入 9倍体积的 ReagentⅠ。置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5 min。

注意：ReagentⅡ有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

• Working ReagentⅢ：临用前配制，用 ReagentⅢ Buffer将 ReagentⅢ Stock solution 稀释 400倍，即取 1倍体积的 ReagentⅢ Stock solution加入 399倍体积的 ReagentⅢ Buffer。

样本制备

1. 血清（浆）样本：直接检测。
2. 动物组织样本：按照 0.1 g组织加入 1 mL 的 Extraction Buffer的比例，冰浴匀浆。8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。
3. 细胞和细菌样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按 5×106细菌或细胞加入 1 mL Extraction Buffer，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 10 s，重复 30次）；8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。
4. 植物组织样本：按 0.1 g组织加入 1 mL 的 Extraction Buffer的比例，冰浴匀浆后超声波破碎（冰浴，功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 10 s，重复 30 次）。8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。

注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
2. 该试剂盒提取的动植物组织样本也可以适用于 KTB1123、KTB1126的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中加入 10 μL样本、20 μLWorking ReagentⅢ、170 μLWorking ReagentⅡ，混匀，立即记录 340 nm处 20 s时的吸光值 A1和 5 min 20 s后的吸光值 A2，计算ΔA测定=A1-A2。

注意：需使用 96孔 UV板或微量石英比色皿，实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 血清（浆）PEPC活力计算

单位定义：pH 8.0条件下，每mL血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

2. 组织、细菌或细胞中 PEPC活力计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；V 反总：反应总体积，0.2 mL；V 样本：加入样本体积，0.01 mL；V 样总，加入 Extraction Buffer体积，1 mL；cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；T：反应时间，5 min；500：细菌或细胞总数，5×10⁶。

B.使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。