羟自由基含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 532 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水、PBS
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Working Reagent II：临用前配制；48 T每瓶 Reagent II 加入 7.5 mL ReagentⅠ，96 T每瓶 Reagent II 加入 15 mL ReagentⅠ，充分溶解待用。用不完的试剂 4℃避光保存 1个月。

Working Reagent III：临用前配制；取一瓶 Reagent IV 全部转移至一瓶 Reagent III 中充分溶解待用。可超声至完全溶解，用不完的试剂 4℃避光保存 1周，若变粉色则弃掉。

Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

样本制备

1. 组织：称取约 0.2 g样本，加入 1 mL ReagentⅠ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌或细胞：收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL ReagentⅠ，冰浴超声波破碎细菌或细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。若浑浊则离心后取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 532 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 1.5 mL离心管中操作）：

混匀，35℃避光反应 1 h。

混匀，95°C 反应 10 min，取出后冰浴冷却至室温，12,000 g，25℃离心 10 min，每管取出 200 μL加入 96孔板或微量玻璃比色皿中记录 532 nm处吸光值。对照孔记为 A 对照，测定孔记为 A 测定。计算ΔA=A 测定-A 对照。

结果计算

OH-含量的计算：

（1）按蛋白浓度计算

单位定义：每 mg蛋白样本在反应中每小时使 532 nm处 OD值变化 0.001定义为一个羟自由基单位。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每 g样本在反应中每小时使 532 nm处 OD 值变化 0.001定义为一个羟自由基单位。

（3）按细菌或细胞数量计算：

单位定义：每 104细菌或细胞在反应中每小时使 532 nm处 OD 值变化 0.001定义为一个羟自由基单位。

（4）按液体体积计算

单位定义：每 mL液体样本在反应中每小时使 532 nm处 OD值变化 0.001定义为一个羟自由基单位。

V 样：加入反应体系中样本体积，0.06 mL；V 样总：加入 ReagentⅠ的体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细菌或细胞数量，以 104计；T：反应时间，1 h；A：吸光值单位。