IF专题| IF疑难杂症逐一击破
免疫荧光技术（IF）是基于抗原抗体特异性结合原理，将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）的一门技术。
在日常IF实验中，大家耗费精力千辛万苦取来的样本，经过信心满满的一通操作，满心期待最终成果，结果却看不到任何荧光信号或者有着超高的背景信号，心一下子凉了。即使废寝忘食优化条件，重复实验，搞得头疼头大，还是找不到问题原因，开始陷入自我怀疑，感觉人生不值得！莫慌，本期我们就要带领大家将这些疑难杂症逐一击破，迎接IF实验的春天。
疑难杂症问题一
信号微弱或无信号，可能原因
- 样品保存不当，如果荧光基团长时间暴露于光下，可能会导致信号衰减，荧光淬灭。
建议：荧光抗体孵育和样品储存过程注意避光。可使用抗荧光淬灭剂，对样品封片。封片后尽量立即成像拍照，以获取最佳结果。
- 细胞/组织样品不新鲜
建议：使用新鲜样本制备破片，以避免丧失抗原性。
- 固定不充分
建议：使用固定剂对样本进行快速/彻底清洗。对于磷酸化特异性抗体，使用浓度至少为4%的甲醛来抑制内源性磷酸酶，充分固定。
- 抗体使用不当，抗体浓度过低或者孵育时间过短
建议：参照说明书中建议抗体浓度进行孵育，抗体在 4°C 下过夜孵育可获得最佳结果。
- 靶蛋白未成功诱导表达
建议：在IF检测之前使用WB或其它方式确认蛋白成功表达，设置阳性对照。应针对每种靶标确定最佳处理条件和对照。
- 目的蛋白表达较低
建议：考虑放大信号或与更亮的荧光团配对。
- 检测组织中不存在目的蛋白
建议：增设阳性及阴性对照。
- 抗原修复与通透方法不当
建议：对于石蜡切片样本，需要进行抗原修复，释放被遮蔽的抗原决定簇；若靶蛋白位于细胞内应对细胞进行彻底通透，使抗体充分进入细胞识别靶蛋白。注意：用丙酮固定的样品不需要进行通透处理。
- 二抗使用不正确
建议：检查二抗是否与一抗的宿主相匹配，并按建议浓度使用。
- 激发波长错误
建议：确保实验所使用激发光，发射光及发射滤光片与对应荧光团的激发波长相匹配。选择使用正确的激光器
- 多重IHC中信号较弱
建议：延长切片脱蜡时间，使用新配制的二甲苯。选择使用最佳信号放大方法。
疑难杂症问题二
高背景
可能原因
- 样品自发荧光
建议：以未经染色的样品为对照，检测自发荧光程度。更换新的甲醛固定剂，陈旧的固定剂可能会产生自发荧光；对于低丰度靶标，选择较长的波长通道。
- 封闭不充分
建议：使用与二抗同一物种来源的正常血清，适当延长封闭时间，4℃过夜是最佳封闭条件。
- 抗体使用不当，一抗或二抗浓度过高或孵育时间过长
建议：使用建议的抗体稀释度，抗体孵育时间不易过长，一抗可4℃过夜封闭，二抗孵育时间1-3小时即可。
- 样品变干
建议：在整个染色过程中始终保持样品处于液体中，避免样本变干。
- 清洗不充分
建议：充分清洗以去除残余固定剂、抗体等非特异性结合作用。
- 二抗交叉反应性
建议：使用同型对照抗体，以确定二抗是否发生交叉反应。
- 二抗本身非特异性结合严重
建议：建议设置阴性对照，不孵育一抗，直接对样本进行二抗孵育，观察非特异性结合情况。若有非特异性结合，建议更换二抗。
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