免疫沉淀实验的疑难点汇总与突破

在细胞世界里，没有蛋白是一座孤岛，都需要与其他蛋白发生相互作用而发挥功能。找 “蛋白朋友”最常见的方法便是免疫沉淀 (IP)/免疫共沉淀 (Co-IP)。

而在免疫沉淀实际操作过程中，宝子们却会遇到很多难点，这里小编凭着真抓实干的精神，沙里淘金，精选出以下常问到的难点，在这里与大家做一个突破性的分享。

1、免疫共沉淀与免疫沉淀的区别？

免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。

免疫共沉淀

免疫沉淀

2、Gst pull-down与Co-IP的区别？

▶ 免疫共沉淀：利用抗原抗体反应的特异性；

▶ GST Pull down：一般指用一个带GST标签的重组蛋白，与目的蛋白进行孵育，最后用结合GST的Beads拉下相互作用复合物；

3、IP实验IP抗体和WB抗体需要不同种源吗？

最好选择两个不同种源的抗体。选择同一种源的抗体的问题在于：在WB之前进行的蛋白变性这一步，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇，巯基乙醇会把抗体的重链和轻链之间的二硫键破坏， 从而使得抗体变成重链分子55KD和轻链分子25KD。假设你IP的抗体是兔抗的，目的蛋白进行WB的抗体也是兔抗的，而且目的蛋白的分子量为55KD，可以想象，55KD的位置除了你的目的蛋白以外，还有IP抗体的重链IgG。由于IP的抗体用量非常大（1ug），就导致55KD处的信号会非常强。如果你用抗兔的二抗进行显色，那么55KD处的ip抗体的重链和你的目的蛋白会重叠在一起，无法分辨。

然而这个时候如果你的目的蛋白进行WB的抗体不是兔抗的，比如小鼠抗的，那么就需要用抗小鼠的二抗进行显色，而抗小鼠的二抗是无法跟兔抗的IP抗体发生反应的。因此55KD位置的IP抗体的重链IgG就无法显色，发生反应的就是你的目的蛋白了。

4、免疫共沉淀中的input是指什么？免疫共沉淀阴性对照的意义是什么？

input是阳性对照。免疫共沉淀实验中，会直接取细胞裂解液进行WB，用于验证细胞裂解液中确实存在目的蛋白，即阳性对照。

阴性对照是用来排出污染的可能性，例如检测一个兔子细胞的某种蛋白质，若没有设置IgG的对照，而操作中有非特异性蛋白质，又和设计的抗体有作用，就会出现阳性的结果。如果做了阴性对照，也就是lgG对照，对照没有出现阳性就说明没有非特异性的蛋白，对照出现阳性，说明抗体有非特异结合的可能，需要重新开始实验。

5、免疫沉淀Co-ip实验中如何去除重链轻链的影响？

a：1.IP一抗与WB一抗来源一致；2. 两种抗体来源不一致时，二抗有交叉反应：使用IPkine二抗可以避免轻重链的干扰；

b：靶蛋白丰度较低，仪器延长曝光时间，导致IgG阴性对照出现杂带：增加Input和IP泳道上样量，减少曝光时间，防止轻重链（杂带）的干扰；

c：阴性对照IgG和IP一抗加入偏多：对照IgG抗体量较多，易导致杂带形成，阴性对照IgG使用量建议调整到1ug以下。

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