一次讲透Annexin V-488/PI凋亡检测
在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧，而在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V(Annexin V) 是一种分子量为35~36KDa的钙离子依赖型磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。通过荧光素或者生物素标记Annexin V即可简单快速地直接检测出细胞早期凋亡情况。碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的，对PI有拒染性。但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核染上。因此将Annexin V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
二、检测数据展示
Fig.1. Hela cells were induced with camptothecin for 24 hours and stained with Annexin V- AbFluor™ 488/PI Apoptosis Detection Kit. The cell is a late stage apoptotic/necrotic cell with both Annexin V- AbFluor™ 488 and PI staining (green membrane with red fragmented nucleus).
Fig.2. Hela cells were induced with camptothecin for 24 hours and stained with Annexin V- AbFluor™ 488 Apoptosis Detection Kit. The combination of AbFluor™ 488 and propidium iodide allows for the distinction between early apoptotic cells (Annexin V- AbFluor™ 488 positive), late apoptotic and/or necrotic cells (Annexin V- AbFluor™ 488 and propidium iodide positive), and viable cells (unstained).
三.产品特色
该试剂盒不仅具有检测方便、结果灵敏，可区分早期凋亡、晚期凋亡、坏死细胞的特点。最特别的是，该试剂盒是市面上唯一一款加入重要可靠的阳性对照品的双染试剂盒，贴心地为您解决结果非标准化的问题。
阳性对照的目的是排除假阴性，阳性对照就是一个样本已知必然是阳性的结果，如果检测出来不是阳性，则说明实验有问题，不可靠。
当要对抗癌药物处理后的HeLa细胞进行检测时，发现处理组的结果呈现阴性，HeLa细胞不发生凋亡。那么，到底是药物无效，还是我的操作不行呢？
阳性对照就有大作用了！！！
当阳性对照组结果是阳性，那么，实验操作一定没有问题，有可能是药不行。
当阳性对照组结果是阴性的，那么，实验操作一定有问题，有可能药物是有效的，出现了假阴性的结果。
四、Annexin V双染法的操作步骤
1）通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物；
2）4 °C，300 g离心5分钟收集1-2×105细胞，用冰预冷的PBS洗涤两次；
3） 用100 μL 1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞；
4） 每100μL细胞悬液中加入4-5 μL Annexin V- AbFlour TM 488 和 1-2 µL PI，轻柔混匀；
5）室温避光孵育15 min；
6）孵育结束后加入400µL 1×Annexin V Binding Buffer，轻柔混匀后置于冰上。染色后 30 min 内通过流式细胞仪分析细胞。使用491 nm 和 535 nm 激发，517 nm 和 617 nm 附近测量荧光。
五、注意事项
- 细胞的上清在操作过程中需要进行收集，因为凋亡的细胞可能会脱壁，悬浮于培养基，所以需要收集上清再离心取沉淀，合并消化下来的细胞，不然会对凋亡比例有影响；
- 对贴壁细胞而言，消化是最关键的步骤，消化液需用不含 EDTA 的胰酶，因为 Annexin V 和 PS 的结合需要 Ca2+，而 EDTA 是 Ca2+螯合剂，使用含有 EDTA 的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长，吹打细胞要轻柔，因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性；
- 神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。
- 必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。
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