乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒实验解决方案

原理乙醛脱氢酶（EC 1.2.1.10，ALDH）是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。主要作用是将乙醛氧化成乙酸，在酒精代谢中起主要作用。在人类和许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。在辅酶Ⅰ存在的条件下，乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，在340 nm处的吸光值会增加，测定340 nm处的吸光值变化，可计算得出乙醛脱氢酶的活性。
自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、制冰机、离心机·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。注意：Extraction Buffer和Reagent II有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。Working Reagent：临用前配制；根据样本数量，按Reagent I：Reagent II=200 µL:10 µL的比例混合，充分混匀，现用现配。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心20 min，取上清液，置冰上待测。2.细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞3 min（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min），然后10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。3.血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或紫外分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。2.将Working Reagent在37℃预热10 min以上。3.操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中进行）：

试剂	测定孔（μL）
样本上清	20
Working Reagent	180
充分混匀，于340 nm处测定初始吸光值A1，37℃孵育30 min后于340 nm处测定吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.01可适当加大样本量或适当延长反应时间（比如反应60 min）。如果ΔA大于1.0，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。A.使用96孔UV板测定的计算公式如下（1）按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每mg蛋白每分钟催化还原1 nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。ALDH (U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=107.17×ΔA÷Cpr（2）按样本质量计算:酶活定义：每g样品每分钟催化还原1 nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。ALDH (U/g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T=107.17×ΔA÷W（3）按照细胞数量计算:酶活定义：每104个细胞每分钟催化还原1 nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。ALDH (U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×500÷V样总)÷T=107.17×ΔA÷500（4）按液体体积计算:酶活定义：每mL样本每分钟催化还原1 nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。ALDH (U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T=107.17×ΔAε：NADH微摩尔消光系数，6.22×10-3 L/µmol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，0.2 mL；V样：反应体系中样本体积，0.02 mL；V样总：加入Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30 min；500：细胞总数，5×106。B.使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中光径d: 0.5 cm调整为d: 1 cm进行计算即可。注意事项1.Reagent II有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。