甲醛脱氢酶（FDH）活性检测试剂盒实验解决方案

原理甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物，对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶（FDH）作为含锌中等链醇脱氢酶（ADH）的家庭成员之一，广泛存在于原核和真核生物中，该酶能利用NAD+作为辅酶，将有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途径中的关键酶。FDH催化甲醛和NAD+产生NADH，在340 nm处的吸光值会增加，测定340 nm处的吸光值变化，可计算得到FDH的活性。
自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、制冰机、离心机·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。ReagentⅡ：临用前配制；48 T加入3 mL去离子水，96 T加入6 mL去离子水，充分溶解待用。用不完的试剂-20℃分装保存一个月。ReagentⅢ：临用前配制；48 T加入0.75 mL去离子水，96 T加入1.5 mL去离子水，充分溶解待用。用不完的试剂4℃避光可保存一个月。ReagentⅣ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。注意：ReagentⅣ有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心20 min，取上清液，置冰上待测。2.细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞3 min（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min），然后10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。3.血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.酶标仪或紫外分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中进行）：

试剂	测定孔（μL）
样本	20
ReagentⅠ	110
Reagent II	50
Reagent III	10
Reagent IV	10
充分混匀，于340 nm处测定初始吸光值A1与30 min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，若样本数量较多，可将试剂按比例配成工作液使用。如果ΔA小于0.01可适当加大样本量或适当延长反应时间（比如反应60 min）。如果ΔA大于1.0，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。A.使用96孔UV板测定的计算公式如下（1）按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每mg蛋白每分钟催化生成1 nmol NADH的酶量为1个酶活单位。FDH (U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=128.6×ΔA÷Cpr（2）按样本质量计算:酶活定义：每g样品每分钟催化生成1 nmol NADH的酶量为1个酶活单位。FDH (U/g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T=128.6×ΔA÷W（3）按照细胞数量计算:酶活定义：每104个细胞每分钟催化生成1 nmol NADH的酶量为1个酶活单位。FDH (U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×500÷V样总)÷T=128.6×ΔA÷500（4）按液体体积计算:酶活定义：每mL样本每分钟催化生成1 nmol NADH的酶量为1个酶活单位。FDH (U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T=128.6×ΔAε：NADH微摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，0.2 mL；V样：反应体系中样本体积，0.02 mL；V样总：加入Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30 min；500：细胞总数，5×106。B.使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中光径d: 0.5 cm调整为d: 1 cm进行计算即可。注意事项1.Reagent IV有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。