乙醇含量检测试剂盒实验解决方案

原理酒是含酒精（乙醇）饮料的统称，乙醇是酒的主要成分，是衡量酒质量的重要指标之一。乙醇可用于制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等，医疗上常用体积分数为 70%~75%的乙醇作消毒剂。乙醇在化学工业、医疗卫生、食品工业、农业生产等领域都有广泛的用途。CheKine™ 乙醇含量检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织，细菌和细胞、血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，乙醇在乙醇脱氢酶的催化下氧化脱氢生成乙醛，同时，NAD被还原生成NADH，NADH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色，通过450 nm下测定吸光值变化可测得乙醇含量。
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测450 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管·水浴锅、离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。ReagentⅡ：临用前配制；48 T加入3 mL Reagent III，96 T加入6 mL Reagent III，充分溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。ReagentⅣ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。注意：ReagentⅣ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。Working Reagent：每孔准备160 µL Working Reagent，现配现用。吸取100 µL ReagentⅠ，50 µL Reagent II和10 μL Reagent IV，混合均匀。Standard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。5 µmol/mL 标准品：临用前取58.4 μL标准品加入941.6 μL去离子水配成1,000 μmol/mL的标准溶液；再取50 μL 1,000 μmol/mL的标准溶液加入950 μL去离子水配成50 μmol/mL的标准溶液；再取100 μL 50 μmol/mL的标准溶液加入900 μL去离子水配成5 μmol/mL的标准溶液用于下述标准孔的测定。
样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL去离子水，冰浴匀浆，8,000 g，室温离心10 min，取上清液待测。2.细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1 mL去离子水，冰浴超声波破碎细菌或细胞30次（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s），然后8,000 g，室温离心10 min，取上清液待测。3.血清（浆）等液体样本：直接检测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到450 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

试剂	标准孔（μL）	测定孔（μL）
样本	0	40
Standard	40	0
Working Reagent	160	160

3.充分混匀，记录450 nm处吸光值A1和37℃避光孵育10 min后的吸光值A2，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定。计算ΔA=A2-A1。注意：标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测定大于0.6，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。乙醇含量的计算（1）按样本蛋白浓度计算：乙醇(μmol/mg prot)=[C标准×(ΔA测定÷ΔA标准)×V样]÷(Cpr×V样÷V样总)=5×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr（2）按样本鲜重计算：乙醇(μmol/g 鲜重)=[C标准×(ΔA测定÷ΔA标准)×V样]÷(W×V样÷V样总)=5×ΔA测定÷ΔA标准÷W（3）按照细菌或细胞数量计算乙醇(μmol/104)=[C标准×(ΔA测定÷ΔA标准)×V样]÷(n×V样÷V样总)=5×ΔA测定÷ΔA标准÷n（4）按样本体积计算：乙醇(μmol/mL)=C标准×(ΔA测定÷ΔA标准)=5×ΔA测定÷ΔA标准C标准：标准溶液的浓度，5 μmol/mL；V样：加入反应体系中的样本体积，0.025 mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；n：细菌或细胞数量，万；W：样本质量，g。