维生素E（VE）含量检测试剂盒实验解决方案

原理维生素E（VE）是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是生物体中最主要的抗氧化剂之一，能阻止不饱和脂肪酸受到过氧化作用的损伤，维持不饱和脂肪酸细胞膜的完整性和正常功能，具有延缓衰老、预防溶血性贫血作用，在医药、化妆品、保健品、食品行业具有较高的应用价值。VE还原Fe3+为Fe2+，Fe2+与1,10-菲罗啉产生有色络合物，在530 nm有特征吸收峰。
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测530 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、离心机、涡旋震荡仪·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。注意：Extraction Buffer有刺激性气味，ReagentⅠ有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，匀浆后用Extraction Buffer定容至1 mL，在漩涡震荡仪上震荡5 min，于5,000 g，25℃离心10 min，取上清液待测。2.细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞3 min（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min），然后在漩涡震荡仪上震荡5 min，于5,000 g，25℃离心10 min，取上清液待测。3.血清（浆）等液体样本：取0.1 mL，加0.9 mL Extraction Buffer，漩涡仪震荡上震荡5 min，于5,000 g，25℃离心10 min，取上清液待测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min，调节波长到530 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

试剂	对照孔（μL）	测定孔（μL）
样本上清	100	100
ReagentⅠ	20	20
Reagent II	0	20
Reagent III	20	0
充分混匀，25℃孵育5 min
Reagent IV	60	60
混匀，于530 nm处测定吸光值，分别记为A对照、A测定，计算ΔA=A测定-A对照。

注意：每个测定孔需设一个对照孔，实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA小于0.02，可适当增大样本量；若反应体系产生沉淀，或者样本的ΔA大于0.5，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，再进行实验，乘以最终的稀释倍数。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。A.用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下标准条件下测定回归方程为：y=0.22x+0.0065, R2=0.9978；x为标准品（μg/mL），y为ΔA。（1）按照蛋白含量计算VE (μg/mg prot)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V反总÷(V样×Cpr)=9.09×(ΔA-0.0065)÷Cpr（2）按照样本质量计算VE (μg/g 鲜重)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V反总÷(V样×W÷V样总)=9.09×(ΔA-0.0065)÷W（3）按照细胞数量计算VE (μg/104 cell)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V反总÷(V样×N÷V样总)=9.09×(ΔA-0.0065)÷N（4）按照液体体积计算VE (μg/mL)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V反总÷V样×10=90.9×(ΔA-0.0065)V反总：反应总体积，0.2 mL；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数量，万。B.用96孔板测定的计算公式如下标准条件下测定回归方程为：y=0.11x+0.0065, R2=0.9978；x为标准品（μg/mL），y为ΔA。（1）按照蛋白含量计算VE (μg/mg prot)=(ΔA-0.0065)÷0.11×V反总÷(V样×Cpr)=18.18×(ΔA-0.0065)÷Cpr（2）按照样本质量计算VE (μg/g 鲜重)=(ΔA-0.0065)÷0.11×V反总÷(V样×W÷V样总)=18.18×(ΔA-0.0065)÷W（3）按照细胞数量计算VE (μg/104 cell)=(ΔA-0.0065)÷0.11×V反总÷(V样×N÷V样总)=18.18×(ΔA-0.0065)÷N（4）按照液体体积计算VE (μg/mL)=(ΔA-0.0065)÷0.11×V反总÷V样×10=181.8×(ΔA-0.0065)V反总：反应总体积，0.2 mL；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数量，万。
注意事项1. 离心后，在吸取上层正庚烷抽提液时，切勿将中间无水乙醇与水的液相层吸入，以免影响试验结果。2. 比色皿需用无水乙醇冲洗，勿用去离子水以防出现分层影响试验数据。3. 显色结束后尽快完成测定。