甜菜碱含量检测试剂盒实验解决方案

原理甜菜碱是一种广泛分布于动植物及微生物体内的季铵型水溶性生物碱，是生物体内胆碱的氧化产物，可以增强免疫力、降血脂、抗氧化、抗肿瘤，并可作为甲基供体，参与促进动物蛋白质和脂肪代谢、增进食欲、缓和应激、调节渗透压、稳定维生素等多种生物作用，在化工、医药、食品添加剂等领域有较广泛的应用。CheKine™ 甜菜碱含量检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织等生物样本。在该试剂盒中，甜菜碱在强酸条件下和雷氏盐发生反应产生沉淀，沉淀用丙酮溶解形成红色溶液，在525 nm处有特征吸收峰，测定525 nm处的吸光值，可得样本的甜菜碱含量。
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测525 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水、乙醚、浓盐酸、丙酮·匀浆器或研钵、40目筛
试剂准备Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Working Reagent I：临用前配制；每瓶加15 mL去离子水，用浓盐酸调pH为1，搅拌30 min溶解，过滤后用去离子水定容至20 mL。现用现配。Reagent II：99%乙醚，取无水乙醚59.4 mL，加入去离子水0.6 mL，混匀。（自备）Reagent III：70%丙酮，取丙酮42 mL，加入去离子水18 mL，混匀。（自备）Standard：临用前配制；加入1 mL去离子水将标准品充分溶解得10 mg/mL的甜菜碱溶液。4℃避光保存1个月。标准品制备：使用10 mg/mL的甜菜碱标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号		Standard体积（μL）		去离子水体积（μL）		浓度（mg/mL）
Std.1	45 μL 10 mg/mL Standard		455		0.9
Std.2	40 μL 10 mg/mL Standard		460		0.8
Std.3	35 μL 10 mg/mL Standard		465		0.7
Std.4	30 μL 10 mg/mL Standard		470		0.6
Std.5	25 μL 10 mg/mL Standard		475		0.5
Std.6	20 μL 10 mg/mL Standard		480		0.4
Std.7	15 μL 10 mg/mL Standard		485		0.3
Std.8	10 μL 10 mg/mL Standard		490		0.2

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。组织：取烘干后过40目筛的样品约0.02 g，加0.8 mL去离子水，置于60℃提取30 min，期间不断震荡。再加入200 µL Extraction Buffer，混匀后10,000 g，25℃，离心10 min，取上清液待测。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到525 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在1.5 mL离心管中操作）：

试剂	空白孔（μL）	标准孔（μL）	测定孔（μL）
样本	0	0	300
Standard	0	300	0
去离子水	300	0	0
Working ReagentⅠ	300	300	300
混匀，4℃反应2 h，14,000 g，25℃，离心10 min，弃上清
Reagent II	500	500	500
混匀，14,000 g，25℃，离心10 min，弃上清。置于通风橱使残余乙醚自然挥发干净
Reagent III	300	300	300

3.震荡使沉淀充分溶解，取200 µL于96孔板或微量玻璃比色皿，记录525 nm处吸光值，空白孔记为A空白，标准孔记为A标准，测定孔记为A测定。计算ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。注意：空白管和标准管只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测定大于0.9 mg/mL的ΔA标准，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA测定带入方程得到x (mg/mL)。2.甜菜碱含量的计算按样本干重计算：甜菜碱(mg/g 干重)=x×V标准÷(V样÷V样总×W)=x÷WV标准：标准品体积，0.3 mL；V样：反应中样本体积，0.3 mL；V样总：加入Extraction Buffer体积，1 mL；W：样本质量，g。