肝脂酶活性检测试剂盒实验解决方案
肝脂酶活性检测试剂盒实验解决方案
自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测595 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、制冰机、离心机·去离子水、丙酮·研钵或匀浆器
试剂准备Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温，若有沉淀析出属正常现象，室温静置至沉淀消失即可（期间请勿大力摇晃）。4℃保存。Reagent IV：临用前配制；48 T加入0.7 mL去离子水，96 T加入1.4 mL去离子水，吹打至充分溶解，用不完的试剂-20℃分装避光可以保存2周，避免反复冻融。Standard：临用前配制；加入1 mL丙酮配制成10 µmol/mL的α-萘酚标准溶液，用不完的试剂-20℃避光可以保存2周。注意：Reagent II有毒，Standard有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。标准品制备：吸取30 μL 10 µmol/mL的α-萘酚标准溶液于EP管中，向其中加入930 μL Reagent I配制成0.3125 µmol/mL的α-萘酚标准品，现用现配。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Reagent I，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2.血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min，调节波长到595 nm。可见分光光度计用去离子水调零。2.将Reagent III在30℃预热20 min以上。3.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：
试剂 | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） | 标准孔（μL） | 空白孔（μL） |
样本上清 | 20 | 20 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 0 | 20 | 0 |
Reagent I | 80 | 90 | 80 | 100 |
Reagent II | 10 | 0 | 10 | 10 |
混匀，30℃反应10 min | 无需反应，直接加入以下试剂 | |||
Reagent III | 80 | 80 | 80 | 80 |
Reagent IV | 10 | 10 | 10 | 10 |
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。HL活力的计算：（1）按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每mg蛋白每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 µmol的α-萘酚为一个酶活力单位。HL (U/mg prot)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(Cpr×V样)÷T×F=0.03125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr×F（2）按样本鲜重计算：酶活单位定义：每g组织每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 µmol的α-萘酚为一个酶活力单位。HL (U/g 鲜重)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷(W×V样÷V样总)÷T×F=0.03125×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F （3）按样本体积计算：酶活单位定义：每mL血清每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 µmol的α-萘酚为一个酶活力单位。HL (U/mL)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷V样÷T×F=0.03125×ΔA测定÷ΔA标准×FC标准：α-萘酚标准品浓度，0.3125 μmol/mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入Reagent I总体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，10 min；W：样品质量，g；F：样本稀释倍数。
注意事项1.Reagent III出现气泡可静置，待气泡消失，加样时不要吸到气泡。2.Reagent IV可能会析出少量沉淀，吹打使其充分溶解。3.若样本为动物肝脏，建议将样本用Reagent I稀释25倍以上再进行检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。若样本为肥胖型动物血清或血浆，建议将样本用Reagent I稀释5倍以上再进行检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。
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