总巯基测定试剂盒实验解决方案

原理生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质，而且参与活性氧清除，后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和谷胱甘肽含量，能够间接测定蛋白质巯基含量。巯基基团与5, 5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412 nm处有最大吸收峰。
自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测412 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、制冰机、离心机·去离子水、无水乙醇·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent II：临用前配制；48 T加入0.8 mL无水乙醇，96 T加入1.6 mL无水乙醇充分溶解备用。4℃避光可以保存一个月。注意：Reagent II有毒，建议在通风橱进行实验。Standard：临用前配制；加入1.3 mL去离子水配制成25 µmol/mL的谷胱甘肽标准品备用，4℃避光可保存2周。标准品制备：使用25 μmol/mL谷胱甘肽标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号		Standard体积		去离子水体积（µL）		浓度（μmol/mL）
Std.1	20 µL 25 μmol/mL Standard		980		0.5
Std.2	500 µL of Std.1 (0.5 μmol/mL)		500		0.25
Std.3	500 µL of Std.2 (0.25 μmol/mL)		500		0.125
Std.4	500 µL of Std.3 (0.125 μmol/mL)		500		0.063
Std.5	500 µL of Std.4 (0.063 μmol/mL)		500		0.031
Std.6	500 µL of Std.5 (0.031 μmol/mL)		500		0.016
Std.7	500 µL of Std.6 (0.016 μmol/mL)		500		0.008
Blank	0		500		0

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL去离子水，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2.血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min，调节波长到412 nm。可见分光光度计用去离子水调零。酶促反应（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

试剂	测定孔（μL）	对照孔（μL）	标准孔（μL）	空白孔（μL）
样本上清	40	40	0	0
Standard	0	0	40	0
Reagent I	150	150	150	150
Reagent II	10	0	10	0
无水乙醇	0	10	0	50

混匀，25℃静置10 min后，于412 nm处测定吸光值，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照、ΔA标准=A标准-A空白。注意：每个测定孔需设一个对照孔，标准曲线和空白孔只用测1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测定大于0.8，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1. 标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA测定带入方程得到x (μmol/mL)。2. 总巯基含量的计算：（1）按样本蛋白浓度计算：总巯基含量 (μmol/mg prot)=x×V样总÷Cpr=x÷Cpr（2）按样本鲜重计算：总巯基含量 (μmol/g 鲜重)=x×V样总÷W=x÷W（3）按样本体积计算：总巯基含量 (μmol/mL)=xV样总：加入去离子水体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。