碱性蛋白酶（AKP）活性检测试剂盒实验解决方案

原理碱性蛋白酶（AKP）是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680 nm有特征吸收峰，测定680 nm 吸光度增加速率，从而计算AKP活性。
自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测680 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、恒温箱、制冰机、离心机、磁力搅拌器·去离子水·研钵或匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。注意：Extraction Buffer有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。Reagent I：临用前配制；48 T加入3 mL去离子水，96 T加入6 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂4℃避光可以保存1周。Reagent II：临用前配制；48 T加入5 mL Extraction Buffer，96 T加入10 mL Extraction Buffer，沸水浴中磁力搅拌溶解（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热15-30 min，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用），用不完的试剂4℃避光可以保存1周。Reagent III：临用前配制；48 T加入14 mL去离子水，96 T加入28 mL去离子水，充分溶解，用不完的试剂4℃可以保存1个月。Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。Stardard：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.动物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。2.细菌和真菌：收集500万细菌或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细菌或真菌，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或真菌3 min（功率30%或300 W，超声3 s，间隔7 s），然后8,000 g，4℃离心10 min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。3.血清（浆）等液体样本：直接检测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到680 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.Reagent I、II、III置于40℃孵育30 min。3.操作表（下述操作在1.5 mL离心管中进行）：

试剂	空白管（μL）	标准管（μL）	测定管（μL）	对照管（μL）
粗酶液	0	0	20	20
Reagent I			0	40
Reagent II			40	0
			混匀后置于40℃孵育10 min
Reagent I			40	0
Reagent II			0	40
			混匀后8,000 g，4℃离心10 min，取上清，在新的EP管中加入以下试剂
上清液	0	0	40	40
Standard	0	40	0	0
去离子水	40	0	0	0
Reagent III	200	200	200	200
Reagent IV	40	40	40	40
混匀后置于40℃孵育20 min

4.取200 μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，记录680 nm处吸光值，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照、ΔA标准=A标准-A空白。注意：每个测定管需设一个对照管，标准管和空白管只需做1-2次。如果样本的ΔA测定小于0.01，可适当延长反应时间（20-30 min），即第一步水浴时间，最后计算酶活时对公式进行修改，如果样本的ΔA测定大于1.0，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，再进行实验，乘以最终的稀释倍数。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。AKP活性的计算：（1）按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：40℃每mg蛋白每分钟水解产生1 μmol酪氨酸为1个酶活单位。AKP(U/mg prot)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(Cpr×V反)÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr（2）按样本鲜重计算：酶活单位定义：40℃每g样品每分钟催化水解产生1 μmol酪氨酸为1个酶活单位。AKP(U/g 鲜重)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(W×V反÷V提)÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W（3）按照细菌或真菌数量计算酶活单位定义：40℃每104个细菌或真菌每分钟催化水解产生1 μmol酪氨酸为1个酶活单位。AKP(U/104)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷(n×V反÷V提)÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷n（4）按样本体积计算：酶活单位定义：40℃每mL样品每分钟催化水解产生1 μmol酪氨酸为1个酶活单位。AKP(U/mL)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷V反÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准C标准：0.25 μmol/mL标准酪氨酸溶液；V反总：酶促反应总体积，0.1 mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL；V反：加入反应体系中粗酶液体积，0.02 mL；V提：加入Extraction Buffer总体积，1 mL；T：催化反应时间，10 min；W：样品质量，g；n：细菌或真菌数量，万。