脂蛋白酯酶（LPL）活性检测试剂盒实验解决方案

原理脂蛋白酯酶（LPL）是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞及巨噬细胞等实质细胞合成的一种酶，可催化甘油三脂水解为脂肪酸和单酸甘油酯，以供组织氧化供能和贮存，并在不同的组织表现出不同的生理意义。LPL水解4-硝基苯棕榈酸酯产生4-硝基苯酚，在400 nm有特征吸收峰。
自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测400 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·恒温水浴锅、恒温箱、制冰机、离心机、超声破碎仪·丙酮·研钵或匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Reagent II：临用前配制；48 T加入0.6 mL丙酮，96 T加入1.2 mL丙酮溶解备用，用不完的试剂-20℃避光可以保存4周。Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Standard：5 μmol/mL对硝基苯酚标准溶液，4℃避光保存。注意：Standard有毒，建议在通风橱进行实验。标准品制备：使用5 μmol/mL对硝基苯酚标准液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

序号		Standard体积		ReagentI体积（µL）		浓度（μmol/mL）
Std.1	500 µL 5 μmol/mL Standard		500		2.5
Std.2	500 µL of Std.1 (2.5 μmol/mL)		500		1.25
Std.3	500 µL of Std.2 (1.25 μmol/mL)		500		0.625
Std.4	500 µL of Std.3 (0.625 μmol/mL)		500		0.313
Std.5	500 µL of Std.4 (0.313 μmol/mL)		500		0.156
Std.6	500 µL of Std.5 (0.156 μmol/mL)		500		0.078
Std.7	500 µL of Std.6 (0.078 μmol/mL)		500		0.039
Blank	0		500		0

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.动物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Reagent I，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。2.细胞：收集500万细胞至离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL Reagent I，冰浴超声波破碎细胞3 min（功率300 W，超声3 s，间隔7 s），然后10,000 g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。3.血清（浆）等液体样本：直接检测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到400 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

试剂	对照孔（μL）	测定孔（μL）	标准孔（μL）	空白孔（μL）
样本上清	20	20	0	0
Standard	0	0	20	0
Reagent I	8	0	8	20
Reagent II	0	8	0	8
混匀，45℃孵育10 min			无需孵育，继续加入以下试剂
Reagent III	172	172	172	172
充分混匀，25℃静置2 min，测定400 nm处吸光值，分别记为A对照、A测定、A标准和A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照、ΔA标准=A标准-A空白。

注意：每个测定孔需设一个对照孔，标准曲线和空白孔只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果A测定小于0.05可适当加大样本量。如果A测定大于2.0，样本可用Reagent I进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量，最后计算酶活时对公式进行修改。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA测定带入方程得到x (μmol/mL)。2.LPL活性的计算：（1）按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：在45℃，pH 7.5条件下，每mg蛋白每分钟水解产生1 nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL(U/mg prot)=x×V提取÷(V提取×Cpr)÷T×1,000=100×x÷Cpr（2）按样本鲜重计算：酶活单位定义：在45℃，pH 7.5条件下，每mg蛋白每分钟水解产生1 nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL(U/g 鲜重)=x×V提取÷W÷T×1,000=100×x÷w（3）按照细胞数量计算酶活单位定义：在45℃，pH 7.5条件下，每mg蛋白每分钟水解产生1 nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL(U/104 cell)=x×V提取÷500÷T×1,000=0.2×x（4）按样本体积计算：酶活单位定义：在45℃，pH 7.5条件下，每mg蛋白每分钟水解产生1 nmol 4-硝基苯酚为一个酶活力单位。LPL(U/mL)=x÷T×1,000=100×xV提取：加入Reagent I总体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，10 min；1000：单位换算系数，1 μmol=1,000 nmol；W：样品质量，g；500：细胞总数，5×106。
注意事项1. 测定孔加入试剂二后变浑浊为正常现象。