多胺氧化酶（PAO）活性检测试剂盒实验解决方案

原理多胺氧化酶（Polyamine oxidase, PAO）是催化生物体内多胺氧化的关键酶，通过调节体内多胺水平和生成物的浓度，参与各种植物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程。CheKine™ 多胺氧化酶（PAO）活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，PAO催化多胺氧化产生过氧化氢，在过氧化物酶存在的条件下与底物显色，在500 nm下有特征吸收峰，通过测定吸光值增加速率来反映PAO活性。
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测500 nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。注意：Reagent II和Reagent IV有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。
样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。1.组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Reagent I，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心20 min，取上清液，置冰上待测。2.血清（浆）等液体样本：直接检测。若有沉淀，离心后测定。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到500 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

试剂	测定孔（μL）
样本	20
ReagentⅠ	140
ReagentⅡ	20
ReagentⅢ	10
ReagentⅣ	10

3.迅速混匀，记录500 nm处吸光值A1和30 min后吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.002可适当加大样本量。如果ΔA大于0.5，样本可用ReagentⅠ进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。PAO活性的计算（1）按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每毫克蛋白在每mL反应体系中每分钟A500变化0.001定义为一个酶活力单位。PAO(U/mg prot)=ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.001÷T=333.33×ΔA÷Cpr（2）按样本鲜重计算：酶活单位定义：每克样本在每mL反应体系中每分钟A500变化0.001定义为一个酶活力单位。PAO(U/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.001÷T=333.33×ΔA÷W（3）按样本体积计算：酶活单位定义：每毫升液体在每mL反应体系中每分钟A500变化0.001为一个酶活力单位。PAO(U/mL)=ΔA×V反总÷V样÷0.001÷T=333.33×ΔAV反总：反应体系总体积，0.2 mL；V样：加入的样本体积，0.02 mL；V样总：提取时加入ReagentⅠ的体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30 min；W：样本质量，g。