线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒实验解决方案
自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测660 nm处的吸光度）·恒温箱、制冰机、低温离心机·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·去离子水·匀浆器或研钵
试剂准备ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Reagent Ⅱ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Reagent Ⅲ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。Reagent Ⅳ：临用前配制，48 T加入1 mL去离子水充分溶解，96 T加入2 mL去离子水充分溶解。未用完的试剂需分装后-20℃避光保存1个月，避免反复冻融。Reagent Ⅴ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Reagent Ⅵ：临用前配制，48 T加入2.4 mL去离子水充分溶解，96 T加入4.8 mL去离子水充分溶解后使用。未用完的试剂需分装后-20℃避光保存1个月，避免反复冻融。Reagent Ⅶ：临用前配制，48 T加入7 mL去离子水充分溶解，96 T加入14 mL去离子水充分溶解后使用。未用完的试剂需分装后-20℃避光保存1个月，避免反复冻融。Reagent Ⅷ：临用前配制，48 T加入7 mL去离子水充分溶解，96 T加入14 mL去离子水充分溶解后使用。未用完的试剂需分装后-20℃避光保存1个月，避免反复冻融。Reagent Ⅸ：即用型；室温保存。定磷试剂的配制：配制比例按照去离子水 : Reagent Ⅶ : Reagent Ⅷ : Reagent Ⅸ=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，现用现配）。注意：配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。标准曲线设置：按下表所示用去离子水将10 mM标准品稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM的标准溶液。
序号 | 标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mM） |
Std.1 | 100 µL 10 mM | 900 | 1 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (1 mM) | 100 | 0.5 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (0.5 mM) | 100 | 0.25 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (0.25 mM) | 100 | 0.125 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (0.125 mM) | 100 | 0.0625 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (0.0625 mM) | 100 | 0.0313 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (0.0313 mM) | 100 | 0.0156 |
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。线粒体呼吸链复合体Ⅴ的提取：1.准确称取0.1 g组织或收集500万个细胞，加入1 mL ReagentⅠ和10 µL Reagent Ⅲ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆；2.离心匀浆液，600 g，5 min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；3.再次离心上清，11,000 g，10 min，4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；4.(选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅴ（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）；5.在沉淀中加入800 µL Reagent Ⅱ和8 µL Reagent Ⅲ，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅴ酶活性检测。实验步骤1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到660 nm，可见分光光度计用去离子水调零。2.酶促反应（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂 | 空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） | 对照管（μL） |
Reagent IV | 0 | 0 | 10 | 10 |
Reagent V | 0 | 0 | 40 | 40 |
样本 | 0 | 0 | 50 | 0 |
混匀后盖紧，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确孵育30 min | ||||
Reagent VI | 0 | 0 | 20 | 20 |
样本 | 0 | 0 | 0 | 50 |
1. 混匀后，室温（25℃左右），4,000 g，离心10 min，取上清液。 | ||||
2. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂） | ||||
试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
上清 | 0 | 0 | 40 | 40 |
Standards | 0 | 40 | 0 | 0 |
去离子水 | 40 | 0 | 0 | 0 |
定磷试剂 | 200 | 200 | 200 | 200 |
3. 混匀，室温静置10 min后，测定660 nm吸光值。计算ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白。（空白管只需做1管） | ||||
注意：1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5）可用Reagent Ⅱ稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA测偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值，若ΔA测出现负值，则说明样本中不含复合体Ⅴ或已降解。2. Reagent Ⅲ具有一定的毒性，Reagent Ⅸ具有腐蚀性，请操作时做好防护措施。3. 该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1880的测定。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.标准曲线的绘制以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。2.无机磷(Pi)含量的计算将∆A测带入方程得到y值(mM)。3.线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性计算(1) 按样本鲜重计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算：上清中复合体Ⅴ活性(U/g鲜重)=(y上清×V酶促×106)÷(V样÷V提取×W)÷T=80.8×y上清÷W沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算：沉淀中复合体Ⅴ活性(U/g鲜重)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V样÷V重悬×W)÷T=64.64×y沉淀÷W样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性的计算：样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性之和。按样本质量计算：线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性(U/g鲜重) =80.8×y上清÷W+64.64×y沉淀÷W(2) 按细胞密度计算单位的定义：每1万个细胞每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性(U/104 cells)=(y×V酶促×106)÷(V样÷V重悬×500)÷T=0.129×yV酶促：酶促反应体系总体积，1.2×10-4 L；106：单位换算系数，1 mmol=106 nmol；V样：加入样本体积，0.05 mL；T：反应时间，30 min；V提取：提取体系体积，1.01 mL；W：样本重量，g；V重悬：重悬沉淀体积，0.808 mL；500：细胞总数，500万。
结果展示典型标准曲线：
Figure 1. 96孔板分析的线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线实验实例：1.取0.1 g绿萝组织进行样本处理，按照测定步骤操作，用96孔板测得：ΔA上清=A测定-A对照=0.404-0.267=0.137，ΔA沉淀=A测定-A对照=0.355-0.142=0.213将∆A上清及ΔA沉淀带入方程，得到y上清=0.1518，y沉淀=0.23582.按样本质量计算得：上清中复合体Ⅴ活性(U/g鲜重)=80.8×y上清÷W=80.8×0.1518÷0.1=122.654 U/g沉淀中复合体Ⅴ活性(U/g鲜重)=64.64×y沉淀÷W=64.64×0.2358÷0.1=152.421 U/g则总复合体Ⅴ(U/g鲜重)=80.8×y上清÷W+64.64×y沉淀÷W=122.654+152.421=275.075 U/g
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