一氧化氮（NO）含量检测试剂盒实验解决方案
一氧化氮（NO）含量检测试剂盒实验解决方案
自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测540 nm处的吸光值）·恒温培养箱·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·去离子水、PBS (pH 7.4)·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备NaNO2 Standard (1 M): 使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；分装避光保存于-20℃。 Griess Reagent I：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。 Griess ReagentⅡ：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。 VCl3 Reagent：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。ZnSO4：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。 标准曲线设置：取10 µL NaNO2 Standard (1 M)用 990 µL PBS (pH 7.4)稀释至10 mM NaNO2 Standard储备液Ⅰ。取10 µL 10 mM 的NaNO2 Standard储备液Ⅰ用990 µL PBS (pH 7.4)稀释至100 µM NaNO2 Standard储备液Ⅱ。用100 µM Standard储备液Ⅱ按下表所示，进行下一步稀释：
序号 | 100 µM Standard储备液Ⅱ (μL) | PBS (pH 7.4) (μL) | 浓度 (µM) |
Std.1 | 200 | 0 | 100 |
Std.2 | 100 | 100 | 50 |
Std.3 | 40 | 160 | 20 |
Std.4 | 20 | 180 | 10 |
Std.5 | 10 | 190 | 5 |
Std.6 | 4 | 196 | 2 |
Std.7 | 2 | 198 | 1 |
Blank | 0 | 200 | 0 |
注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备1.动植物组织或细胞样本：称取约0.1 g组织样本或收集500万个细胞，加入1 mL PBS (pH 7.4)，冰浴匀浆，14,000 rpm，4℃离心10 min，取上清液待测。2.血浆，血清和尿液（和其他生物体液）：直接将样品加入96孔板或微量玻璃比色皿。需要进行去蛋白的样品包括血清、血浆、全血、含有FBS的细胞培养基、组织或细胞裂解物。尿液和唾液不需要脱蛋白。脱蛋白处理：将150 μL样品与8 μL ZnSO4混合在1.5 mL EP管中，旋涡，然后14,000 rpm，4℃离心10 min。将100 μL的上清液转移到干净的EP管中。注意：建议您使用新鲜样品，如果不立即实验，样品可在-80℃保存一个月。如果样品需要脱蛋白，则每种标准品应制备150 μL，并同样用硫酸锌处理，避免结果计算中需要使用稀释因子。抗氧化剂和亲核剂（例如β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇和半胱氨酸）可能会干扰检测。在样品制备过程中避免使用这些化合物。
实验步骤1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到540 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。2.工作液的配制：每孔需要200 μL工作液，为避免损失，按204 µL每孔体系配制：吸取104 μL VCl3 Reagent，50 μL Griess Reagent Ⅰ和50 μL Griess ReagentⅡ。工作液需现配现用。3.将100 μL稀释的标准品和样品添加到单独标记的EP管中（建议样品至少重复测量2次）。然后在每个样品和标准管中加入200 μL工作液，混合均匀。 4.将反应体系在37℃下孵育30 min。5.对反应管进行短暂离心以去除不溶物，并将每个反应体系中分别取250 μL液体转移到96孔板或微量玻璃比色皿中。在540 nm处读取A值，分别标记为ABlank, AStandard和ASample。所有A值减去空白孔A值，计算ΔAStandard=AStandard-ABlank, ΔASample=ASample-ABlank。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A值>1.0，则说明样本NO含量太高，需用PBS（pH 7.4）适当稀释（计算公式中乘以相应稀释倍数）。如果样本的ΔASample低于0.005，可提高样本量。
结果计算以标准液浓度为x轴，ΔAStandard为y轴，绘制标准曲线。将ΔASample带入方程得到x值（µM）即NO含量。换算：1 mg/dL NO相当于333 μM，0.001%或10 ppm。
结果展示典型标准曲线：以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
Figure 1. 96孔板分析的NO标准曲线相关产品
Catalog No. | Product Name |
KTB1010 | CheKine™ 辅酶Ⅱ NADP(H)含量检测试剂盒（微量法） |
KTB1020 | CheKine™ 辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒（微量法） |
KTB1030 | CheKine™ 超氧化物歧化酶 (SOD)活力检测试剂（微量法） |
KTB1070 | CheKine™ 黄嘌呤氧化酶(XO)活性分析试剂盒（微量法） |
