线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒实验解决方案
线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒实验解决方案
自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测550 nm处的吸光度）·恒温箱、制冰机、低温离心机·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·去离子水·匀浆器或研钵
试剂准备ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Reagent Ⅱ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Reagent Ⅲ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。工作液的配制：临用前，将Reagent Ⅴ和Reagent Ⅵ依次转移到Reagent Ⅳ中混合溶解，如果检测样本是哺乳动物来源，请置于37℃孵育5 min；如果样本是其他物种，则置于25℃孵育5 min。用不完的试剂分装后-20℃避光保存1周，禁止反复冻融。
样本制备注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。线粒体呼吸链复合体Ⅳ的提取：1.准确称取0.1 g组织或收集500万个细胞，加入1 mL ReagentⅠ和10 µL Reagent Ⅲ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆。2.离心匀浆液，600 g，5 min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀。3.再次离心上清，11,000 g，10 min，4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作。4.(选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅳ，用于判断线粒体提取效果。5.在沉淀中加入200 µL Reagent Ⅱ和2 µL Reagent Ⅲ，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅳ酶活性检测。
实验步骤1.酶标仪和可见分光光度计预热30 min以上，调节波长至550 nm，可见分光光度计用去离子水调零。2.在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入200 µL工作液和10 µL样本，充分混匀后，立即读取550 nm处0 min的初始吸光值A1和1 min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。注意：1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果ΔA过高（高于1.0），可用Reagent Ⅱ稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值，若ΔA出现负值，则说明样本中不含复合体Ⅳ或已降解。2. 线粒体呼吸链试剂盒是酶动力学原理的试剂盒，反应比较快，且反应趋于平衡之后，该可逆反应可能会出现负反应，建议如下：（1）样本组数：2-3个左右，该酶促反应速度快，且为酶促反应，需要把握好起始时间点和反应后的时间点；（2）仪器提前预热，且加样可安排在酶标仪旁边进行，加样混匀后直接放入；（3）如果ΔA偏小，可增加样本量（组织克重或者细胞数量），或者减少提取液用量；（4）样本尽量新鲜提取，如果不能马上使用，则把完整细胞或者分装的组织保存在-80℃，一个月内使用；（5）工作液临用前配制。3. 该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1890的测定。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1. 使用96孔板测定的计算公式(1) 按样本鲜重计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1 nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。上清中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力的计算：上清的复合体Ⅳ活力(U/g鲜重)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=2,221×ΔA上清÷W沉淀中复合体Ⅳ活力的计算:沉淀中的复合体Ⅳ活力(U/g鲜重)=[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V重悬×V样)÷T=444×ΔA沉淀÷W复合体Ⅳ总活力的计算：总复合体Ⅳ活力即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力之和。总复合体Ⅳ活力(U/g鲜重)=2,221×ΔA上清÷W+444×ΔA沉淀÷W(2) 按细胞密度计算单位的定义：每1万个细胞每分钟催化降解1 nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力(U/104 cells)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V重悬×500)÷T=0.888×ΔAV反总：反应体系总体积，2.1×10-4 L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，19.1×103 mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；109：单位换算系数，1 mol=109 nmol；V样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，1 min；ΔA上清：上清测定值；W：样本重量，g；V提取：提取体系体积，1.01 mL；ΔA沉淀：沉淀测定值；V重悬：重悬沉淀体积，0.202 mL；500：细胞总数，500万。2. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式将上述计算公式中光径d: 0.5 cm调整为d: 1 cm进行计算即可。
结果展示实验实例：1.取0.1 g小鼠脑组织进行样本处理，按照测定步骤操作，用96孔板测得：ΔA上清=A1-A2=0.4568-0.4446=0.0122，ΔA沉淀=A1-A2=0.4373-0.4188=0.01852.按样本质量计算得：上清中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性(U/g鲜重)=2,221×ΔA上清÷W=2,221×0.0122÷0.1=270.962 U/g沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性(U/g鲜重)=444×ΔA沉淀÷W=444×0.0185÷0.1=82.14 U/g则线粒体呼吸链复合体Ⅳ(U/g鲜重)=2,221×ΔA上清÷W+444×ΔA沉淀÷W=270.962+82.14=353.102 U/g
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