二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）检测试剂盒实验解决方案

原理1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco, EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性直接影响着光合速率。CheKine™ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）检测试剂盒（微量法）可检测植物组织样本的Rubisco的活性，其原理是在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH氧化生成NAD+；在340 nm NADH有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，测定340 nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。
自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·制冰机、低温离心机、水浴锅·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备Extraction BufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Extraction BufferⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Working ReagentⅡ：临用前配制，对于48 T，加5.5 mL ReagentⅠ溶解；对于96T，加11 mL ReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。Working ReagentⅢ：临用前配制，对于48 T，加5.5 mL ReagentⅠ溶解；对于96T，加11 mL ReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。Working ReagentⅣ：临用前配制，对于48 T，加0.6 mL ReagentⅠ溶解；对于96T，加1.2 mL ReagentⅠ溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。Working Solution：临用前将Working ReagentⅡ和Working ReagentⅢ按1: 1混合，根据实验需求配制相应的体积。现用现配。
样本制备粗酶液制备：1. 总Rubisco酶提取：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction BufferⅠ，冰浴匀浆，超声波破碎1 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s），8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2. 胞浆和叶绿体Rubisco酶的分离：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction BufferⅠ，冰浴匀浆，200 g，4℃离心5 min，弃沉淀，取上清，8,000 g，4℃离心10 min，离心后取上清用于测定胞浆Rubisco酶活性，取沉淀加1 mL Extraction BufferⅡ，震荡溶解后超声破碎1 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s），8,000 g，4℃离心10 min，取上清测定叶绿体中Rubisco酶活性。注意：建议测定总Rubisco酶活性，按照步骤1提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco，则按照步骤2提取粗酶液。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长到340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。2. 操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作）：

试剂	空白孔（μL）	测定孔（μL）
样本	0	10
去离子水	10	0
Working ReagentⅣ	10	10
Working Solution	180	180

3. 迅速混匀后于340 nm检测，记录20 s和5 min 20 s的吸光值，测定孔的记为A1和A2，空白孔的记为A3和A4，计算ΔA测=(A1-A2)-(A3-A4)。注意：空白孔只需测定1次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测大于0.6，样本可用对应的Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。A. 使用96孔UV板测定的计算公式(1) 按样本蛋白浓度计算单位的定义：25℃中，每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1 nmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。Rubisco (U/mg prot)=[ΔA测×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=1,286×ΔA测÷Cpr(2) 按样本质量计算单位的定义：25℃中，每g组织在反应体系中每分钟催化1 nmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。Rubisco (U/g 质量)=[ΔA测×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本)÷T=1,286×ΔA测÷WV反总：反应体系总体积，0.2 mL=2×10-4 L，V提取：提取液体积，1 mL；V样本：反应体系中上清液体积，0.01 mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔UV板直径，0.5 cm；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；T：反应时间，5 min；W：样本质量，g。A.使用微量石英比色皿进行测定的计算公式将上述计算公式中光径d: 0.5 cm调整为d: 1 cm进行计算即可。
结果展示称取0.1 g拟南芥叶片加入1 mL Extraction BufferⅠ进行匀浆研磨，取上清，之后按照测定步骤操作，用96孔UV板测得：A1=0.918，A2=0.842，A3=0.863，A4=0.863，ΔA=(A1-A2)-(A3-A4)=(0.918-0.842)-(0.863-0.863)=0.076，按样本质量计算酶活得：Rubisco (U/g 质量)=1,286×ΔA÷W=1,286×0.076÷0.1=977.36 U/g。
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