结合态淀粉合成酶（GBSS）活性检测试剂盒实验解决方案

原理结合态淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS，EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。CheKine™ 结合态淀粉合成酶（GBSS）活性检测试剂盒（微量法）可检测植物组织样本。在该试剂盒中，GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340 nm下测定NADPH的增加量，可以计算GBSS活性。
自备耗材·酶标仪或紫外光分光光度计（能测340 nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。注意：Extraction Buffer有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Working Reagent II：临用前配制；Reagent II A 48 T加入8.4 mL ReagentⅠ，96 T加入16.8 mL ReagentⅠ，缓慢加热，逐渐升温至煮沸使其溶解，冷却后与Reagent II B和Reagent II C混匀溶解待用。用不完的试剂-20℃避光分装保存2周，避免反复冻融。Reagent III：临用前配制；48 T加入4.8 mL ReagentⅠ，96 T加入9.6 mL ReagentⅠ，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。Reagent IV：临用前配制；48 T加入6 mL ReagentⅠ，96 T加入12 mL ReagentⅠ，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。Reagent V：临用前配制；48 T加入0.225 mL去离子水，96 T加入0.45 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。Reagent VI：临用前配制；48 T加入0.225 mL去离子水，96 T加入0.45 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。
样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，弃上清液，在沉淀中加入1 mL Extraction Buffer充分混匀，置冰上待测。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤1.酶标仪或紫外光分光光度计预热30 min以上，调节波长到340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。2.操作表（下述操作在1.5 mL EP管中操作）：

试剂	测定孔（μL）
样本	75
Working Reagent II	135
混匀，30℃保温20 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却
Reagent III	75
混匀，30℃保温30 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，10,000g，4℃离心10 min，取上清液。下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作：
上清液	150
Reagent IV	100
Reagent V	5
Reagent VI	5

3.充分混匀，立即记录340 nm处10 s时吸光值A1和130 s时的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.02可适当加大样本量。如果ΔA大于0.6，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含GBSS或已降解。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。GBSS活性的计算A.使用96孔UV板测定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。GBSS (U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T×1.9=1,059×ΔA÷Cpr(2)按样本鲜重计算：酶活单位定义：每克样本每分钟产生1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。GBSS (U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×1.9=1,059×ΔA÷WV反总：反应体系总体积，2.6×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L /mol /cm；d：96孔UV板光径，0.5 cm；V样：加入样本体积，0.075 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；1.9：稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。B.使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中光径d：0.5 cm调整为d：1 cm进行计算即可。
结果展示以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。Figure 1. 本试剂盒测定南瓜和玉米种子中GBSS的活性。
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