氧基抗氧化能力（ORAC）检测试剂盒实验解决方案

原理氧基抗氧化能力（Oxygen Radical Absorbance Capacity, ORAC）是一种检测各种样品中生物分子抗氧化能力的经典方法。ORAC方法对抗氧化性能的评价具有特异性好、灵敏度高、测定范围广，以及适合抗氧化活性的高通量筛选等优点，在天然产物抗氧化提取物中得到越来越多的应用，食品及功能食品企业普遍采用ORAC作为功能食品的重要评价标准。CheKine™ 氧基抗氧化能力（ORAC）检测试剂盒（荧光法）可检测动物或植物组织、细胞或细菌、血清（浆）等样本，其原理是以荧光素钠为荧光探针，偶氮类化合物AAPH作为过氧自由基来源，根据自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化，荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度。在抗氧化剂存在时，它可以抑制由自由基引起的荧光变化，抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力。
自备耗材·荧光酶标仪（激发波长为485 nm，发射波长为525 nm）·全黑96孔板·低温离心机、恒温箱·制冰机·可调节式移液枪及枪头·去离子水、丙酮·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备1×Assay Buffer：使用前，Assay Buffer (2×)用去离子水稀释成1×Assay Buffer，充分溶解待用。4℃保存。1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用1×Assay Buffer稀释成1×Reagent I，充分溶解待用。用不完的ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。不要储存稀释的1×ReagentⅠ溶液。Working ReagentⅡ：临用前配制19 mg/mL ReagentⅡ溶液，现用现配。例如，称量19 mg ReagentⅡ加入1 mL 1×Assay Buffer，充分溶解待用。Working ReagentⅡ溶液不稳定，应立现配现用。注意：ReagentⅠ和ReagentⅡ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。Trolox Standard (5 mM)：使用前，用1×Assay Buffer稀释成0.2 mM浓度，充分溶解待用。用不完的Trolox Standard（5 mM）-20℃避光分装保存，避免反复冻融。Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。

序号	0.2 mM标准品体积 （µL）	1×Assay Buffer体积 （µL）	标准品浓度 （µM）
Std.1	50	150	50
Std.2	40	160	40
Std.3	30	170	30
Std.4	20	180	20
Std.5	10	190	10
Std.6	5	195	5
Std.7	2.5	197.5	2.5
Std.8	0	200	0

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备注意：样本以新鲜为宜，若不能立刻检测，应储存在-80℃保存。1.动物组织：称取0.01-0.1 g样本，加入适量的1×Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。2.植物组织：称取0.01-0.1 g样本，加入适量的1×Assay Buffer捣碎，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。3.细胞或细菌：收集100-500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入适量的1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。4.血浆或血清：用1×Assay Buffer稀释100倍或更多进行检测。5.液体样本：10,000 g，4℃离心10 min，去除微粒，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。6.亲脂性样本：溶于100%丙酮中，用50%丙酮稀释，在室温下孵育1 h，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。7.固体或高蛋白样本：称取固体样本，加入去离子水（1:2，w/v），冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去离子水洗涤，将此洗涤液与水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用1×Assay Buffer稀释并直接用于分析。而不溶物部分加入纯丙酮（1:4, w/v）在室温下混合30-60 min来进一步提取。10,000 g，4℃离心10 min，取丙酮提取物的上清液用50%丙酮稀释。通过将水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的结果相结合，计算出总ORAC值。注意：该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1502的测定。
实验步骤1.荧光酶标仪预热到37℃，激发波长为485 nm，发射波长为525 nm。2.操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：

试剂	空白孔（μL）	标准孔（μL）	测定孔（μL）
1×Assay Buffer	25	0	0
Standard	0	25	0
上清	0	0	25
1×ReagentⅠ	150	150	150
混匀，37℃孵育30 min
Working ReagentⅡ	25	25	25

3.混匀，立即用荧光酶标仪读取荧光值，每5 min读取1次，总共60 min。荧光酶标仪的测定条件为激发波长为485 nm，发射波长为525 nm，仪器温度保持在37℃。注意：空白孔和标准孔只需做1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。空白孔的最终测定值应小于初始值的10%。
结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。ORAC值根据荧光衰减曲线下净面积(Area Under the Curve, AUC)=[AUC待测样(抗氧化剂) - AUC(空白)]计算抗氧化剂的活性。1. 从下面的等式计算AUCAUC=1+RFU1/RFU0+RFU2/RFU0+RFU3/RFU0+……+RFU59/RFU0+RFU60/RFU0RFU0=0 min的相对荧光值。RFUx=x min的相对荧光值。（例如，RFU5是5 min时的相对荧光值）2. 计算净AUC：Net AUC=AUC(样本)-AUC(空白)。3. 标准曲线的绘制：以标准品浓度为y轴，净AUC为x轴，绘制标准曲线。4. 将样本的Net AUC带入方程得到y值（μM），以微摩尔每升Trolox当量（TE）或每克样品的TE（μmol TE/ g或μmol TE/ L）表示ORAC值。注意：若样本进一步稀释，则需要再乘以进一步稀释的稀释倍数n。

结果展示典型标准曲线：Figure 1. ORAC的标准曲线。实验实例：取0.1 g动物组织加入1 mL 1×Assay Buffer进行匀浆研磨，取上清，稀释50倍，之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得:样本的AUC为6.715，空白的AUC为2.820，净AUC=AUC(样本)-AUC(空白)=6.715-2.820=3.895，标准曲线为y=4.9679x-0.916，Trolox浓度为18.43 µM，ORAC值(样本)=18.43 µM×50(稀释因子)=921.5 µM TE=921.5 µmol TE/L。
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Catalog No.	Product Name
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