超氧阴离子含量检测实验方案：从样本制备、标准曲线到结果计算

超氧阴离子含量检测的操作步骤不算多，但实际做起来，有几个地方很容易出错。

比如，实验需要两次孵育、一次三氯甲烷萃取，还要同时设置测定管、对照管、空白管和标准管。不同反应管的试剂组成只差一两项，如果没有提前整理好加样表，很容易漏加或加错。

这篇文章按照实际做实验的顺序，介绍样本制备、试剂用量计算、标准曲线配制、显色检测和结果计算。文末附有标准品配制表和完整反应体系表，操作时可以直接对照。

一、开始实验前，先确定三件事

1. 根据样本类型，选择前处理方法

动物组织、植物组织、细胞和血清（浆）的处理方式不同，取样量和需要准备的仪器也不一样。

植物组织和细胞类样本的超声参数相同：功率 20% 或 200 W，超声 3 s、间隔 7 s，累计处理 5 min。

建议尽量使用新鲜样本。如果不能立即检测，可在 -80 ℃ 保存 1 个月。

组织和细胞样本如果需要按蛋白浓度计算结果，还应另外测定蛋白浓度，例如使用 KTD3001（BCA 法）进行检测。

2. 提前确定结果的计算单位

超氧阴离子检测结果可以按照不同的样本信息进行归一化，常见的有四种：

• 按样本质量：μmol/g

• 按细胞、细菌或真菌数量：μmol/10⁴ 个

• 按液体体积：μmol/mL

• 按蛋白浓度：μmol/mg prot

每种方式又可以分别计算超氧阴离子含量和产生速率。

因此，样本处理前就需要确定采用哪种计算方式。

例如，按组织质量计算，需要记录样本鲜重；按细胞数量计算，需要记录实际细胞数；按蛋白浓度计算，则需要有对应的蛋白浓度数据。

这些信息最好在样本处理时同步记录，避免实验结束后无法完成归一化计算。

3. 正式检测前，建议做预实验

第一次使用试剂盒，或者更换了样本类型，建议先选择 2–3 个预期差异较大的样本进行预实验。

预实验主要确认两件事：

• 样本读数是否落在标准曲线范围内。

• 测定管与对照管的吸光度差值是否合理。

确认检测条件适合当前样本后，再进行正式实验，可以减少样本和试剂消耗。

试剂盒在标称规格之外额外提供了约 10% 的试剂量，可用于标准曲线和预实验。

二、先计算反应管数和试剂用量

这个实验需要设置四类反应管：

每个样本对应 1 个测定管和 1 个对照管。每次实验另外设置 1 个空白管和 7 个标准管。

因此：

总管数 = 2 × 样本数 + 8

需要注意的是，Reagent Ⅰ 只加入测定管、空白管和标准管，对照管不加。

所以，计算 Reagent Ⅰ 用量时，不能直接按总管数计算。

以 12 个样本为例

假设本次检测 12 个样本，每个样本只做单管检测，不设置技术复管。

以上仅用于演示用量计算，不代表推荐的实验分组。

实际配液时，还需要在计算值基础上适当增加用量，以补偿移液损耗。

检测用试剂使用前应按要求平衡至室温。Reagent Ⅱ 和 Reagent Ⅲ 需要避光保存，准备和使用时应尽量减少光照暴露。

三、实验当天怎么安排？

实验包含两次 37 ℃ 孵育，每次 20 min，萃取后还需要离心 5 min。

这三个步骤合计 45 min，不包括样本前处理、加样、混匀及读数时间。

实际操作可以按下面的顺序进行。

第一步：准备仪器和试剂

• 酶标仪提前预热 30 min 以上，检测波长设为 540 nm。

• 水浴锅调至 37 ℃。

• 试剂按要求平衡至室温。

• 准备冰盒，用于样本前处理及上清液暂存。

第二步：制备待测样本

根据样本类型，按照第一部分的方法进行匀浆、超声或其他前处理。

组织和细胞类样本离心后，取上清置于冰上，供后续检测使用。

血清（浆）可直接检测，必要时使用 Extraction Buffer 稀释。

第三步：配制 NaNO₂ 标准品

标准品母液为 10 mmol/L NaNO₂ Standard。

先使用 Extraction Buffer 将其稀释至 200 μM，再依次进行二倍梯度稀释，得到以下 7 个浓度：

200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μM。

完整配制方法见附录表 1。

注意：稀释后的标准品不稳定，应在 4 h 内使用完毕。

因此，标准品应在实验当天现配现用，不建议提前一天完成稀释。

可以利用酶标仪预热或样本离心的时间进行配制。

第四步：加入反应试剂，第一次孵育

使用 1.5 mL EP 管，按附录表 2 分别配制测定管、对照管、空白管和标准管。

本步骤的主要区别在于：

• 测定管：加入样本 40 μL、Extraction Buffer 60 μL、Reagent Ⅰ 80 μL。

• 对照管：加入样本 40 μL、Extraction Buffer 140 μL，不加 Reagent Ⅰ。

• 空白管：加入 Extraction Buffer 100 μL、Reagent Ⅰ 80 μL。

• 标准管：加入对应浓度的标准品 40 μL、Extraction Buffer 60 μL、Reagent Ⅰ 80 μL。

充分混匀后，在 37 ℃ 孵育 20 min。

此时，四类反应管的总体积均为 180 μL。

第五步：加入显色试剂，第二次孵育

第一次孵育结束后，向所有反应管分别加入：

• Reagent Ⅱ：60 μL

• Reagent Ⅲ：60 μL

充分混匀，在 37 ℃ 再孵育 20 min。

加完两种试剂后，每管总体积为 300 μL。

第六步：三氯甲烷萃取

第二次孵育结束后，在化学通风橱内向每管加入三氯甲烷 100 μL。

充分混匀后，按以下条件离心：

• 温度：25 ℃

• 离心力：8000 g

• 时间：5 min

三氯甲烷挥发性较强，使用移液器吸取时，可先用三氯甲烷润洗枪头几次，并留意吸液后是否发生滴漏。这属于一般的有机溶剂移液操作注意事项。

第七步：转移上层水相，测定吸光度

离心后，小心吸取上层水相 200 μL，加入 96 孔板。

使用酶标仪在 540 nm 处读取吸光度。

分别记录：

• A测定：测定管吸光度

• A对照：对照管吸光度

• A空白：空白管吸光度

• A标准：标准管吸光度

取液时尽量不要碰到下层有机相。

按照反应体系的加入体积估算，萃取前水相约 300 μL，三氯甲烷为 100 μL。实际分层后应以观察到的液面位置为准。

吸取 200 μL 上层水相时，枪头浅入液面即可，不需要伸到管底。

加样时还有两点需要留意

一是核对各阶段的总体积。

如果同一批反应管中，有某管液面明显不同，应检查是否存在漏加或重复加样。确认加样出错的反应管，建议重新检测。

二是尽量保持同批样本的孵育时间一致。

样本量较大时，从第一管加试剂到最后一管，可能相隔数分钟。

为了减少这种时间差带来的影响，可以根据个人加样速度合理安排每批反应管的数量，并保持各管操作节奏一致。

这是一般实验操作中的注意事项，并非试剂盒额外规定的特殊步骤。

四、实验结束后，如何整理吸光度数据？

完成检测后，需要先计算吸光度差值，再利用标准曲线求出对应浓度。

以 0.1 g 小鼠肝脏样本为例：

1. 计算吸光度差值

样本使用测定管减去对应的对照管：

ΔA测定 = A测定 − A对照

本例中：

ΔA测定 = 0.094 − 0.069 = 0.025

标准品则使用标准管减去空白管：

ΔA标准 = A标准 − A空白

2. 建立标准曲线

以 ΔA标准 为横坐标 x，以标准品浓度（μmol/L）为纵坐标 y，绘制标准曲线。

试剂盒提供的典型曲线为：

y = 316.95x − 0.6274

R² = 0.9994

这条曲线仅作为示例，正式实验需要使用当次测得的标准品数据重新建立标准曲线。

将样本的 ΔA测定 = 0.025 代入典型曲线：

y = 316.95 × 0.025 − 0.6274

得到：

y ≈ 7.29 μmol/L

后续根据样本类型和归一化方式计算检测结果。

五、超氧阴离子含量和产生速率怎么计算？

试剂盒提供了四种归一化方式。下面整理的是化简后的计算公式。

各参数含义如下：

不同样本的计算公式

这里需要分清两个结果：

超氧阴离子含量反映按照所选归一化方式计算的检测结果。

超氧阴离子产生速率则是在上述含量结果基础上，除以 20 min 反应时间得到的数值。

因此，在本试剂盒的计算体系中，同一样本的产生速率数值是对应含量数值的 1/20。

论文或实验报告中应明确标注结果类型及单位，不能将两者混用。

示例：0.1 g 小鼠肝脏样本

已知：

• y = 7.29 μmol/L

• W = 0.1 g

• n = 1

按照样本质量计算：

超氧阴离子含量 = 0.002 × 7.29 ÷ 0.1 × 1

结果约为 0.146 μmol/g。

如果计算产生速率：

0.0001 × 7.29 ÷ 0.1 × 1

结果为 0.00729 μmol/min/g。

细胞样本的 N 怎么填写？

N 不是直接填写细胞的实际个数，而是需要换算成以 10⁴ 个为单位的数值。

例如，标准流程使用 5×10⁶ 个细胞：

N = 5×10⁶ ÷ 10⁴ = 500

因此，按细胞数量计算时：

• 含量 = 0.000004 × y × n

• 产生速率 = 0.0000002 × y × n

如果实际取样细胞数不是 5×10⁶ 个，则应使用实际的 N 值进行计算。

改变取样量后，还能直接使用这些公式吗？

上表的化简公式采用以下默认参数：

• V样本 = 0.04 mL

• V提取 = 1 mL

如果实验过程中改变了提取液体积或反应取样体积，就需要按照实际参数重新计算，不能继续直接使用原来的化简系数。

产品官网提供了在线计算器，可输入实验数据辅助计算，也可以用来核对手算结果。

六、检测中遇到异常读数怎么办？

1. 样本读数超过标准曲线最高点

可以使用 Extraction Buffer 进一步稀释样本，再重新检测。

计算最终结果时，需要计入相应的稀释倍数。

也可以考虑适当减少提取时的样本用量。

2. 样本 ΔA测定 低于 0.005

当样本吸光度差值过低时，可适当增加样本量后重新检测。

3. 标准曲线出现明显偏离

可以先检查两个地方：

• 梯度稀释过程中是否出现移液误差。

• 稀释后的标准品是否放置超过 4 h。

这是一般的标准曲线异常排查思路。标准曲线数据应以当次实验实际检测结果为准。

七、操作安全及其他注意事项

三氯甲烷操作

三氯甲烷属于挥发性有机溶剂。加样以及离心后的样品转移应在化学通风橱中进行，并做好个人防护。

试剂防护

Reagent Ⅰ 有刺激性气味，Reagent Ⅱ 具有毒性。操作时应穿实验服，佩戴适当的手套及其他必要防护用品，避免直接接触试剂。

检测用途

本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。

其他检测仪器

除酶标仪外，本试剂盒也可使用分光光度计检测，但需要根据分光光度计的检测要求，按比例调整反应体系的配制量。

附录：实验操作对照表

表 1：NaNO₂ 标准品配制

使用 Extraction Buffer 稀释 NaNO₂ Standard，标准品应在每次实验时现配。

表 2：超氧阴离子检测反应体系

单位：μL

操作顺序：

1. 按表加入样本或标准品、Extraction Buffer 和 Reagent Ⅰ，充分混匀，37 ℃ 孵育 20 min。

2. 加入 Reagent Ⅱ 和 Reagent Ⅲ，充分混匀，37 ℃ 再孵育 20 min。

3. 加入三氯甲烷，充分混匀后在 25 ℃、8000 g 条件下离心 5 min。

4. 吸取上层水相 200 μL 至 96 孔板，于 540 nm 处测定吸光度。

说明： 本文用于整理超氧阴离子含量检测试剂盒的实验操作、数据记录与计算方法。具体试剂配制、操作参数及结果计算，应以产品随附的正式说明书为准。