应用指南 2026-10-14 阅读

GSSG氧化型谷胱甘肽含量检测实验方案protocol：从样本制备到结果计算

氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽氧化状态的重要形式，在氧化应激、细胞损伤、药物作用以及疾病模型研究中，常用于评价样本中的氧化还原状态变化。

与总谷胱甘肽（T-GSH）检测相比，GSSG检测对样本处理和实验设计要求更高。一方面，GSSG在细胞内含量相对较低，需要保证检测信号处于标准曲线范围内；另一方面，样本提取过程中的处理方式、干扰因素以及结果归一化方式都会影响最终检测结果。

因此，在开展GSSG检测实验前，需要提前规划几个关键环节，包括样本含量是否处于检测范围、不同类型样本采用何种提取方式、试剂如何根据检测孔数进行配制、96孔板如何安排，以及最终检测结果如何计算。

本文以 CheKine™ 氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量检测试剂盒（微量法，货号：KTB1610） 为例，介绍从样本制备、标准曲线建立到结果计算过程中的实验设计要点。

一、样本检测前：确认样本是否处于检测范围

CheKine™ GSSG检测试剂盒的检测范围为 0.78–25 μM，该范围对应的是反应体系中的GSSG浓度，而不是未经处理样本中的实际含量。

由于不同类型样本需要经过不同程度的提取和稀释，因此正式实验前，需要根据样本类型估算样本处理后的浓度是否能够落入检测范围。

按照推荐提取方案，不同样本类型对应的可检测范围如下：

样本类型	推荐提取方式	可检测样本含量
组织	0.1 g样本加入1 mL提取液	约7.8–250 nmol/g
血清（血浆）	60 μL样本加入3倍体积提取液	约3.1–100 nmol/mL
细胞	5×10⁶个细胞加入1 mL提取液	约0.0016–0.05 nmol/10⁴个

提前估算样本含量，主要用于判断后续实验方案。如果样本含量高于检测范围上限，可以使用提取液进行适当稀释，并在计算时乘以相应稀释倍数；如果样本含量低于检测范围下限，则可以考虑增加样本量或减少提取液体积，以提高目标物浓度。

需要注意的是，如果调整了样本提取比例，后续计算公式中的V提取需要按照实际加入体积进行替换。对于非标准提取方案，建议在实验前与技术支持确认。

对于首次检测的新样本类型，建议先选择2–3个具有代表性的样本进行预实验，通过观察样本ΔΔA在标准曲线中的位置，确定正式实验中的样本量和稀释倍数。

二、样本制备：根据样本类型选择合适提取方式

GSSG检测结果不仅受到检测体系影响，样本前处理过程同样会影响最终数据。因此，样本制备过程中需要尽量减少处理时间和温度变化，并避免使用可能干扰检测反应的试剂。

不同类型样本的推荐处理方式如下：

样本类型	推荐处理方式
动植物组织	取0.1 g样本加入1 mL预冷提取液，在冰上快速匀浆后，于4℃、8000 g离心10 min，取上清检测
血清（血浆）	取60 μL样本加入3倍体积提取液，室温静置5 min后，于4℃、8000 g离心10 min，取上清检测
细胞、细菌	取5×10⁶个细胞，用预冷PBS清洗2次后加入1 mL提取液重悬，采用超声或冻融方式破碎，随后4℃、8000 g离心10 min，取上清检测
全血	取60 μL全血加入3倍体积提取液，在冰上快速匀浆后，于4℃、8000 g离心10 min，取上清检测；若表层出现血膜，可再次于4℃、8000 g离心1 min，取澄清上清
红细胞	抗凝血经4℃、1000 g离心10 min后弃去血浆和白细胞层，使用5倍体积预冷PBS清洗2次，取100 μL红细胞加入0.3 mL提取液处理后离心取上清

对于组织样本，匀浆设备建议提前预冷，组织研磨时可优先采用氧化锆研磨珠，以减少处理过程中的温度变化。

细胞或细菌样本破碎时，可采用超声方式处理，参考条件为功率20%或200 W，超声3 s、间隔7 s，重复30次，并保持冰浴条件；也可以采用液氮和37℃水浴快速冻融2–3次完成破碎。

三、样本处理中的关键注意事项

GSSG检测过程中，应避免使用可能影响检测体系的试剂。样本处理时不要使用含DTT、TCEP、β-巯基乙醇、铁离子、半胱氨酸或Tris的试剂，这些成分可能干扰检测反应。

如果实验过程中使用常规裂解液，需要提前确认裂解液组成，避免引入影响检测的成分。

样本建议使用新鲜材料进行检测。细胞样本不建议使用冻存样本；暂时无法检测的样本可以在-80℃保存30天以内，但应尽量减少冻融次数。

由于GSSG提取液中含有蛋白沉淀剂，提取后的检测样本不能直接用于蛋白浓度测定。如果实验结果需要按照蛋白浓度进行归一化（nmol/mg protein），需要另取同来源样本，使用去离子水制备后，再采用BCA法检测蛋白浓度。如果采用样本质量、细胞数量或液体体积进行归一化，则无需额外制备蛋白样本。

四、试剂配制：根据检测孔数规划标准品和工作液

GSSG检测实验中，试剂配制需要根据实际检测孔数进行计算，而不是按照整盒试剂直接配置。由于每次实验都需要建立标准曲线，因此在实验开始前，需要根据样本数量合理规划孔位，并计算所需工作液体积。

1. GSSG标准曲线建立

GSSG标准品需要在每次实验中重新建立标准曲线。标准品检测范围为0.78–25 μM。

标准品粉末使用1 mL Assay Buffer溶解后，配制成10 mM GSSG标准储液。随后取10 μL标准储液加入990 μL提取液，得到100 μM GSSG标准液；再取100 μL 100 μM标准液加入100 μL提取液，得到50 μM标准液。

以50 μM标准液为起始液，继续按照二倍梯度进行稀释，最终得到25、12.5、6.25、3.125、1.5625和0.78125 μM六个标准浓度，同时设置一个仅含提取液的空白孔。

稀释后的标准品建议放置于冰上保存，并在4小时内完成检测。每次实验建议重新制作标准曲线，以保证不同批次实验之间的数据可靠性。

2. 工作液配制

各工作液单孔使用量如下：

工作液	单孔加入量	配制方式
Inhibitor工作液	160 μL	0.5 μL Inhibitor + 160 μL Assay Buffer
酶促工作液	22 μL	0.4 μL GR + 1.6 μL Assay Buffer + 20 μL GR Cofactor工作液
Chromogen	20 μL	即用型，避光平衡至室温

其中，Inhibitor工作液实际每孔加入160 μL，但在配置时建议按照160.5 μL/孔计算，以补偿移液过程中的损耗。

GR Cofactor粉末需要临用前溶解，不同规格对应溶解体积如下：

规格	溶解体积
48 T	1.5 mL去离子水
96 T	3 mL去离子水

GR使用前需要充分混匀。GR Cofactor工作液和酶促工作液建议现配现用，剩余工作液如需保存，应分装后于-20℃避光保存，并避免反复冻融。

3. 根据检测孔数计算工作液用量

实际实验中，应根据检测孔数计算工作液需求量，并适当增加余量。

例如，检测30个样本时，需要30个样本孔，以及6个标准浓度和1个空白组成的7个标准孔，共37个检测孔。考虑移液过程中的损耗，实际配液时可以按照40孔进行准备。

对应工作液用量如下：

工作液	40孔所需量
Inhibitor工作液	6420 μL
酶促工作液	880 μL
Chromogen	800 μL

其中，6420 μL Inhibitor工作液由20 μL Inhibitor和6400 μL Assay Buffer组成；880 μL酶促工作液由16 μL GR、64 μL Assay Buffer以及800 μL GR Cofactor工作液组成。

由于标准曲线每次实验均需要重新建立，如果将样本拆分为多个批次检测，标准孔会重复占用实验孔位。因此，对于样本量较大的实验，建议尽量安排在同一次检测中完成。

五、96孔板布局与检测流程

GSSG检测采用酶促显色反应体系，96孔板布局、加样顺序以及反应时间控制都会影响检测结果。

标准曲线建议固定在同一区域，例如A–G孔依次加入空白、0.78125 μM、1.5625 μM、3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM和25 μM标准品。

样本孔可以按照列方向排列，方便使用多通道移液器进行批量加样，减少不同孔之间的时间差。

检测前建议提前启动酶标仪并预热30 min以上，检测波长设置为412 nm，也可以根据仪器条件选择405 nm作为替代波长。

反应体系建立时，每孔加入20 μL样本、标准品或提取液，再加入160 μL Inhibitor工作液，混匀后37℃避光孵育30 min。随后加入22 μL酶促工作液和20 μL Chromogen，充分混匀后立即读取吸光值A₁。

25℃避光孵育5 min后，再读取吸光值A₂。

实验过程中需要注意，Chromogen加入后应尽快完成检测。样本数量较多时，建议使用多通道移液器，并控制整体加样过程在5 min内完成，以减少不同孔之间的反应时间差。

六、GSSG检测结果计算方法

检测完成后，首先计算吸光值变化量：

ΔA=A₂−A₁

随后扣除空白背景：

ΔΔA=ΔA样本−ΔA空白

以标准品浓度作为纵坐标，以对应ΔΔA作为横坐标建立标准曲线，将样本ΔΔA代入标准曲线方程，即可得到反应体系中的GSSG浓度y（μM）。

部分实验中可能得到类似标准曲线：

y=30.554x+0.7721，R²=0.9973

但实际检测过程中，建议每次实验重新建立标准曲线，不直接套用历史曲线参数。

七、不同归一化方式下的GSSG含量计算

根据样本类型和实验目的不同，GSSG结果可以按照样本质量、细胞数量、液体体积或蛋白浓度进行归一化。

组织样本通常按照样本质量进行归一化，计算公式为：

GSSG（nmol/g）=y×V提取÷W×n

其中，y为标准曲线计算得到的GSSG浓度（nmol/mL），V提取为提取液体积（mL），W为样本质量（g），n为样本稀释倍数。

例如，组织样本量为0.1 g，加入1 mL提取液时：

GSSG（nmol/g）=y×1÷0.1×n

细胞或细菌样本通常按照细胞数量进行归一化，计算公式为：

GSSG（nmol/10⁴个）=y×V提取÷N×n

其中N代表细胞数量（以10⁴个细胞计）。

例如，5×10⁶个细胞对应N=500。

血清、血浆以及全血等液体样本通常按照体积进行归一化。由于液体样本提取时加入3倍体积提取液，因此计算公式为：

GSSG（nmol/mL）=4×y×n

如果实验需要按照蛋白浓度进行归一化，则计算公式为：

GSSG（nmol/mg protein）=y÷Cpr×n

其中Cpr为样本蛋白浓度（mg/mL）。

需要注意的是，由于GSSG提取液中含有蛋白沉淀剂，因此检测样本上清不能直接用于蛋白浓度测定。如果需要按照蛋白浓度归一化，应另取同来源样本，使用去离子水处理后，再采用BCA法检测蛋白浓度。

八、兔脑组织GSSG检测计算实例

以兔脑组织样本为例，说明GSSG检测结果从吸光值到最终含量的计算过程。

实验中取0.1 g兔脑组织，加入1 mL提取液进行处理。检测结果显示，样本孔吸光值为A₂=0.2510、A₁=0.1067，因此：

ΔA样本=A₂−A₁=0.2510−0.1067=0.1443

空白孔吸光值为A₂=0.0877、A₁=0.0863，因此：

ΔA空白=A₂−A₁=0.0877−0.0863=0.0013

根据公式：

ΔΔA=ΔA样本−ΔA空白

可计算得到：

ΔΔA=0.1443−0.0013=0.1430

将样本ΔΔA值代入标准曲线后，得到反应体系中的GSSG浓度：

y=5.141 μM

由于该样本检测过程中未进行稀释，因此：

n=1

根据组织样本计算公式：

GSSG（nmol/g）=y×V提取÷W×n

其中，y=5.141 nmol/mL，V提取=1 mL，W=0.1 g，n=1。

代入计算：

GSSG=5.141×1÷0.1×1=51.41 nmol/g

因此，该兔脑组织样本中的GSSG含量为：

51.41 nmol/g

九、检测结果超出标准范围时如何处理

在实际实验过程中，如果样本检测结果不处于标准曲线范围内，需要根据检测情况调整实验方案。

如果样本ΔΔA超过最高标准浓度对应范围，说明当前样本中的GSSG含量较高，超出了检测体系的线性范围。此时可以使用提取液对样本进行适当稀释后重新检测，并在最终结果计算时乘以相应稀释倍数。

如果样本ΔΔA低于最低标准浓度对应范围，说明当前样本浓度可能不足以获得可靠检测信号。此时可以考虑增加样本量、减少提取液体积或优化样本前处理方式，以提高检测浓度。

需要注意的是，如果改变了样本提取比例，计算公式中的V提取需要按照实际实验条件进行调整。

十、GSSG检测中的常见实验注意事项

GSSG检测结果受到样本状态、处理过程以及检测条件等多方面因素影响。在实验设计过程中，以下几个方面需要重点关注。

首先，标准曲线建议每次实验重新建立。由于试剂状态、实验环境以及操作过程可能影响标准曲线，因此不建议长期直接使用固定曲线参数。

其次，样本处理过程需要保持一致。GSSG容易受到氧化还原环境变化影响，因此实验过程中应尽量避免样本长时间暴露于室温环境，并减少反复冻融。

此外，在进行不同实验组比较时，需要选择合适的归一化方式。组织样本通常按照质量归一化，细胞样本通常按照细胞数量归一化，液体样本通常按照体积归一化。如果研究目的是比较不同样本整体氧化水平，也可以根据实验设计采用蛋白浓度进行归一化。

合理选择结果表达方式，有助于提高不同实验组之间的数据可比性。

十一、GSSG相关指标在氧化应激研究中的应用

在氧化应激相关研究中，GSSG通常不会作为唯一检测指标，而是结合其他氧化还原指标进行综合分析。

常见检测指标包括：

还原型谷胱甘肽（GSH）；
总谷胱甘肽（T-GSH）；
GSH/GSSG比值；
脂质过氧化指标（如LPO、MDA）；
抗氧化相关酶活性指标。

其中，GSH/GSSG比值能够反映细胞氧化还原状态变化，是评价氧化应激水平的重要指标之一。

因此，在实验设计阶段，应根据研究目的选择合适的指标组合，而不是仅关注单一GSSG含量变化。

十二、安全说明

生化检测试剂在实验过程中可能具有刺激性，操作时应做好实验防护，包括穿戴实验服、手套等。

其中，Inhibitor具有刺激性气味，建议在通风条件下进行配制和加样操作。

实验过程中产生的废液，应按照实验室相关规范进行处理。