HA标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)-IPKine™

自备耗材

• 磁分离架
• 垂直旋转混合仪
• 低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• PBS缓冲液
• 匀浆器（组织样本）

试剂准备

• Non-Denaturing Lysis Buffer：天然蛋白裂解液，用于IP样本的提取，即用型；置于冰上待用；4℃保存。
• 1×TBS：临用前配制，向10×TBS中添加去离子水，将10×TBS稀释成1×TBS；4℃保存。
• Anti-HA Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。
• Mouse IgG Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。
• Elution Buffer：即用型；用于非变性的酸洗脱，4℃保存。
• Neutralization Buffer：即用型；用于中和酸洗脱的非变性蛋白，4℃保存。
• Working HA Peptide：临用前用1×TBS将HA Peptide (25×)稀释25倍，即得到Working HA Peptide，置于冰上备用，用于非变性的竞争性洗脱，-20℃保存。
• SDS-PAGE Loading Buffer (5X)：即用型，-20℃保存。

实验步骤

A. 蛋白样品的准备

注意：取一定量的制备好的样本作为全细胞裂解液（WCL）用于后续的Western Blotting检测。

1. 细胞蛋白提取：

1. 细胞收集（贴壁细胞：10 cm细胞培养皿中单层细胞长满80%-90%，吸除细胞培养液，PBS洗涤1次；悬浮细胞：离心收集5×10⁶细胞，PBS洗涤1次）。
2. 0.5-1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer加预冷的PBS到细胞中，4℃裂解细胞5 min，期间用移液枪反复吹打，然后将细胞悬浮液转移到新的离心管中。
3. 12,000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清。

2. 组织蛋白提取：

1. 称取0.1 g组织，加入1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer，匀浆器研磨。（若需要提高蛋白浓度，可以适量减少Non-Denaturing Lysis Buffer用量）。
2. 将匀浆液转移至新的离心管中，冰上裂解5 min。
3. 12,000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清。

3. 细菌蛋白提取：

1. 12,000 rpm，4℃，离心2 min收集细菌，PBS洗涤1次。
2. 每100-200 μL菌液加1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer重悬细菌，冰浴超声波破碎细菌5 min（功率200 W，超声3 s间隔，7 s重复30次）。
3. 12,000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清。

B. 磁珠准备

注意：按照每500 μL蛋白样品取20 μL Anti-HA Magnetic Beads的比例吸取磁珠混悬液。以下实验步骤按照加入20 μL Anti-HA Magnetic Beads的量，进行具体操作说明。

1. 将磁珠加入1.5 mL离心管中，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清。
2. 加入1 mL 1×TBS，重悬磁珠，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清，重复3次，用20 μL 1×TBS重悬磁珠。

C. 免疫沉淀

1. 处理好的Anti-HA Magnetic Beads加入500 μL蛋白样品，置于垂直旋转混合仪室温下孵育1-2 h或4℃过夜。
2. 离心管置于磁分离架上，静置10 s，去除上清。上清液可转移至新的离心管中，用于检测免疫沉淀的效果。
3. 加入1 mL 1×TBS，重悬Anti-HA Magnetic Beads，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清，重复3-5次，直至上清液OD₂₈₀小于0.05。

洗脱

1. a) SDS-PAGE Loading Buffer洗脱法：此方法洗脱的样品适用于变性洗脱法：SDS-PAGE和Western Blotting检测。向离心管中加入100 μL（5倍磁珠体积）1×SDS-PAGE Loading Buffer（用1×TBS将5×SDS-PAGE Loading Buffer稀释5倍）混匀，95℃加热5 min，然后进行离心，800 rpm，1 min，离心收集上清液，进行SDS-PAGE和Western Blotting检测分析。
2. b) 多肽竞争洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入100 μL（5倍磁珠体积）Working HA Peptide混匀，置于垂直旋转混合仪4℃孵育1-2 h，800 rpm，4℃，离心2 min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为HA标签蛋白及其复合物，为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱，HA标签蛋白及其复合物置于4℃待用，-20℃或-80℃长期保存。可向磁珠沉淀中加入100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，用于检测免疫沉淀及洗脱效果。
3. c) 酸洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入100 μL（5倍磁珠体积）Elution Buffer混匀，然后在室温下置于垂直旋转混合仪孵育5-10 min，800 rpm，4℃，离心2 min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为HA标签蛋白及其复合物，收集上清液至新的离心管中，并立即加入10 μL Neutralization Buffer，将洗脱组分调节至pH 7.0-8.0，为了获得最大的洗脱效率，可重复用酸洗脱，并将相同样品合并，HA标签蛋白及其复合物置于4℃待用，-20℃或-80℃长期保存。可向磁珠沉淀中加入100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，用于检测免疫沉淀及洗脱效果。