Flag标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)-IPKine™

自备耗材

• 磁分离架
• 垂直旋转混合仪
• 低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• PBS缓冲液
• 匀浆器（组织样本）

试剂准备

Non-Denaturing Lysis Buffer：天然蛋白裂解液，用于 样本的提取，即用型；置于冰上待用；IP 4℃保存。

1×TBS：临用前配制，向 中添加去离子水，将 稀释成 ；10×TBS 10×TBS 1×TBS 4℃保存。

Anti-Flag Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。

Mouse IgG Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。

Elution Buffer：即用型；用于非变性的酸洗脱，4℃保存。

Neutralization Buffer：即用型；用于中和酸洗脱的非变性蛋白，4℃保存。

Working 3 Flag Peptide× ：临用前用 × 将 × × 稀释 倍，即得到 × ，置于冰上备用，1 TBS 3 Flag Peptide (25 ) 25 Working 3 Flag Peptide 用于非变性的竞争性洗脱，-20℃保存。

SDS-PAGE Loading Buffer (5 )× ：即用型；-20℃保存。

注意：（ ）蛋白酶抑制剂不是必须加入，可根据实验需求在1 Non-Denaturing Lysis Buffer中分别添加选择不同类型的蛋白酶抑制剂；（ ）建议使用低吸附的离心管进行磁珠操作，可减少磁珠粘附离心管壁。在 中添加 的非离子型表面活性剂（如 Triton X-100 Tween-20 NP-40、 或 ）也可以有效降低耗材对磁珠的粘附。2 1×TBS 0.01%-0.1%(V/V)

实验步骤

A. 蛋白样品的准备

注意：取一定量的制备好的样本作为全细胞裂解液（ ）用于后续的 检测。WCL Western Blotting

1. 细胞蛋白提取：

1. 10 cm 80%-90% PBS 1细胞收集（贴壁细胞： 细胞培养皿中单层细胞长满 ，吸除细胞培养液， 洗涤 次；悬浮细胞：离心收集 5×10 6 个细胞， 洗涤 次）。PBS 1
2. 0.5-1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer加 预冷的 到细胞中，4℃ 裂解细胞 ，期间用移液枪反复吹打，然后将细胞悬浮液转5 min 移到新的离心管中。
3. 12,000 rpm 4， ℃ ，离心 ，收集上清。10 min

2. 组织蛋白提取：

1. 0.1 g称取 组织，加入 1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer，匀浆器研磨。（若需要提高蛋白浓度，可以适量减少Non-Denaturing Lysis Buffer用量）。
2. 5 min将匀浆液转移至新的离心管中，冰上裂解 。
3. 12,000 rpm 4， ℃ ，离心 ，收集上清。10 min

3. 细菌蛋白提取：

1. 12,000 rpm 4， ℃ ，离心 收集细菌， 洗涤 次。2 min PBS 1
2. 1 mL 100-200 μL Non-Denaturing Lysis Buffer每 菌液加 重悬细菌，冰浴超声波破碎细菌 5 min（功率 或 ，超声 ，20% 200 W 3 s 间隔 ，重复 次）。7 s 30
3. 12,000 rpm 4， ℃ ，离心 ，收集上清。10 min

注意：（ ）样品中必须带有1 Flag-Tag的目的蛋白及其复合物；（ ）免疫沉淀宜用新鲜的蛋白样品为佳；（ ）免疫沉淀实验中不同类型的抗原与抗体间的亲和力是有区别的，抗体与抗原结合还会受到裂解液和缓冲液的影响，如使用 Non-Denaturing Lysis Buffer不能获得最佳的实验结果， 可自行优化操作细节或者筛选及配制合适裂解液和缓冲液进行实验。2 3

B. 磁珠准备

注意：按照每 蛋白样品取 的 的比例，吸取磁珠混悬液。以下实验步骤按照加入500 μL 20 μL Anti-Flag Magnetic Beads 20 μL 的 的量，进行具体操作说明。Anti-Flag Magnetic Beads

1. 1.5 mL 10 s将磁珠加入 离心管中，离心管置于磁分离架上，静置 ，吸弃上清。
2. 1 mL 1 TBS Anti-Flag Magnetic Beads 10 s 3 20 μL 1加入 × ，重悬 ，离心管置于磁分离架上，静置 ，吸弃上清，重复 次，用 × TBS重悬磁珠。

C. 免疫沉淀

1. Anti-Flag Magnetic Beads 500 μL 1-2 h 4处理好的 加入 蛋白样品，置于垂直旋转混合仪室温下孵育 或 ℃过夜。

注意： ）建议酌情在部分样品中加入 进行免疫沉淀以作为阴性对照，可排除 本身和目的蛋白或a Mouse IgG Magnetic Beads IgG 其它特定生物分子的非特异性结合；b）对于使用 进行免疫沉淀后续发现背景非常高的情况，可以考虑Anti-Flag Magnetic Beads 使用 预处理样品，以消除非特异性吸附，然后再使用 进行免疫沉淀。Mouse IgG Magnetic Beads Anti-Flag Magnetic Beads

2. 10 s离心管置于磁分离架上，静置 ，去除上清。上清液可转移至新的离心管中，用于检测免疫沉淀的效果。
3. 1 mL 1×TBS Anti-Flag Magnetic Beads 10 s 3-5加入 ，重悬 ，离心管置于磁分离架上，静置 ，吸弃上清，重复 次，直至上清液 OD280 0.05小于 。
4. 洗脱

• a）变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE Western Blotting 100 μL 5和 检测。向离心管中加入 （ 倍磁珠体积） 1×SDS-PAGE Loading Buffer 1 TBS SDS-PAGE Loading Buffer (5 ) 5 100（用 × 将 × 稀释 倍）混匀， ℃ 加热 ，然后进行离心，5 min 800 rpm 1 min SDS-PAGE Western Blotting 离心 ，收集上清液，进行 和 检测分析。
• b）多肽竞争洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入 （ 倍磁珠体积）100 μL 5 Working 3 Flag Peptide 4× 混匀，置于垂直旋转混合仪 ℃ 孵育 1-2 h， 800 rpm 4， ℃ ，离心 ，吸取上清液，收集洗脱组分，即为 标签蛋白及其复合物，为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱， 标签蛋白及其复合物置于Flag Flag 4℃待用，-20℃或 -80℃ 长期保存。可向磁珠沉淀中加入 100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，用于检测免疫沉淀及洗脱效果。
• c）酸洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入 100 μL（ 倍磁珠体积）5 Elution Buffer 混匀，然后在室温下置于垂直旋转混合仪孵育 ，5-10 min 800 rpm，4℃ ，离心 ，吸取上清液，收集洗脱组分，即为 标签蛋白及其复合物，收集上清液至新的离心管中，并立即加入 ，将洗脱组分 调节至 ，为了获得10 μL Neutralization Buffer pH 7.0-8.0 最大的洗脱效率，可重复用酸洗脱，并将相同样品合并， 标签蛋白及其复合物置于Flag 4℃待用，-20℃或-80℃长期保存。可向磁珠沉淀中加入 100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，用于检测免疫沉淀及洗脱效果。

注意：a）对于少数样品，由于目的蛋白的差异，Flag-Tag Flag与 抗体的结合力非常强，酸洗脱和多肽竞争洗脱的效果可能比较差， 建议优先使用 SDS-PAGE Loading Buffer b变性洗脱法； ）由于目的蛋白的差异，酸性洗脱法的洗脱效率也会存在一定的差异。 如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的 值在 之间进行适当的调整，相应的中和液的 值或量也要进行适当的调整，例如 酸洗脱液（ ）和 中和液（100 μL 0.1 M Glycine-HCl, pH 2.8 15 μL 1 M Tris-HCl, pH 8.5）。pH 2.5-3.1 pH