小鼠白介素-1α ELISA定量试剂盒-EliKine™

自备耗材

• 酶标仪（能测 450 nm 处的吸光度）
• 多通道移液器或自动洗板机
• 恒温箱、低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水

试剂准备

1× Sample Diluent：使用前，平衡到室温，用去离子水按 1:5 的比例稀释 Sample Diluent (5×) 得到 1× Sample Diluent，轻轻混合以避免起泡。4℃保存，此溶液可稳定保存 30 天。1× Sample Diluent 用于稀释标准品，血清和血浆样品。

1× Assay Buffer：使用前，平衡到室温，用去离子水按 1:5 的比例稀释 Assay Buffer (5×) 得到 1× Assay Buffer，轻轻混合以避免起泡。4℃保存，此溶液可稳定保存 30 天。1× Assay Buffer 用于稀释 Mouse IL-1α Detect Antibody (100×) 和 Streptavidin-HRP (100×)。

Mouse IL-1α Standard：加入 500 µL 1×Sample Diluent 复溶得到 500 pg/mL 标准品。在进行稀释之前，将标准品至少放置 15 min 并轻轻晃动。

1× Mouse IL-1α Detect Antibody：稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用 1× Assay Buffer 对 Mouse IL-1α Detect Antibody (100×) 进行 1:100 稀释。1× Mouse IL-1α Detect Antibody 应在稀释后 30 min 内使用。

1× Streptavidin-HRP：稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用 1× Assay Buffer 对 Streptavidin-HRP (100×) 进行 1:100 稀释。1× Streptavidin-HRP 应在 30 min 内使用。

HRP Substrate (TMB)：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Stop Solution：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

1× Wash Buffer：使用前平衡到室温，用去离子水进行 1:20 稀释 Wash Buffer (20×) 得到 1× Wash Buffer。轻轻混合以避免起泡，室温保存，此溶液可稳定保存 30 天。

标准曲线设置

按下表所示，用 1× Sample Diluent 将 500 pg/mL 标准品稀释为 500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.82、0 pg/mL 的标准品。

注意：每次实验都需要新配制标准品。

样本制备

1. 细胞培养上清：离心除去颗粒（1,000 g, 15 min），立即测定或分装 -20℃保存，避免反复冻融。
2. 血清：使用血清分离管，让样品在室温下凝结 30 min，然后 1,000 g 离心 15 min。取上层血清立即测定或分装 -20℃保存，避免反复冻融。
3. 血浆：使用 EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆。在收集后 30 min 内 1,000 g 离心 15 min。立即测定或分装 -20℃保存，避免反复冻融。

注意：不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在 24 h 内使用，则可以将其储存在 2-8℃，避免反复冻融。测定前，应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。

实验步骤

1. 从板框上取下多余的板条，将它们放回装有干燥剂包的铝箔袋中，然后重新密封。
2. 每孔加入 100 μL 稀释的标准品或样品。建议所有标准品和样品做复孔。给酶标板覆膜，在室温下孵育 2 h。
3. 除去每孔中的液体并洗涤，重复该过程总共洗涤三次。使用多通道移液器或自动清洗机每孔加入 250 μL 1×Wash Buffer 进行洗涤，然后静置 1-2 min。在每个步骤中完全去除液体对于获得良好性能至关重要。最后一次洗涤后，倒置酶标板并用干净的纸巾吸干以除去任何剩余的 1× Wash Buffer。
4. 每孔加入 100 μL 1×Mouse IL-1α Detect Antibody。给酶标板覆膜，在室温下孵育 1 h。
5. 重复步骤 3 中的洗涤。
6. 每孔加入 100 μL 1× Streptavidin-HRP。给酶标板覆膜，在室温下孵育 30 min，注意避光。
7. 按照步骤 3 重复洗涤过程 5 次。
8. 每孔加入 100 μL HRP Substrate (TMB)。给酶标板覆膜，并在室温下避光孵育 15 min。
9. 每孔加入 50 μL Stop Solution，Stop Solution 应按照与 TMB 相同的顺序加到板中。孔中的颜色应从蓝色变为黄色。如果孔中的颜色为绿色或颜色变化不均匀，请轻轻敲击板以确保彻底混合。
10. 在 30 min 内，测定每孔 450 nm 处的吸光值。

结果计算

1. 计算每个标准品和样品的复孔平均 OD 值，并减去零浓度（Std.8）平均 OD 值。
2. 标准曲线的绘制：以标准品浓度为 x 轴，各标准品的平均吸光度为 y 轴，绘制标准曲线。可以使用作图软件来创建标准曲线。

注意：如果样品被稀释，从标准曲线读取的浓度必须乘以稀释系数。