蔗糖含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 480 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机、分析天平
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。有刺激性气味和毒性,建议在通风橱进行实验。
• Reagent V：即用型；室温保存。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

植物组织：称取 0.1~0.2 g样本，常温研碎，加入 0.5 mL Extraction Buffer，适当研磨后快速转移到离心管中，置于 80℃水浴锅中 10 min，振荡 3~5次，冷却后，4,000 g，常温离心 10 min，取上清，向上清中加入 2 mg Reagent V，80℃脱色 30 min，再加入 0.5 mL Extraction Buffer，冷却后，4,000 g，常温离心 10 min，取上清液测定。

注意：Extraction Buffer中含有使蛋白变性的成分，若按蛋白浓度计算时，需要用其他裂解液重新提取蛋白进行测定。如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 480 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）：

混匀，沸水浴煮沸 5 min左右（盖紧，防止水分散失）

混匀，沸水浴 30 min，冷却后取 200 μL至微量玻璃比色皿或 96孔板中测定 480 nm处光吸收值，空白管、标准管和测定管分别记为 A 空白、A 标准和 A 测定，计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：标准管和空白管只要做一管。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果 A 测定小于 0.05可适当加大样本量。如果 A 测定大于 2.0，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

（1）按样本蛋白浓度计算：

蔗糖含量(mg/mg prot)=ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr

（2）按样品质量计算：

蔗糖含量(mg/g 鲜重)=ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

C 标准：标准管浓度，1 mg/mL；V 样：加入样本体积，0.025 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。