甲醛脱氢酶(FDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅡ：临用前配制；48 T加入 3 mL去离子水，96 T加入 6 mL去离子水，充分溶解待用。用不完的试剂-20℃分装保存一个月。

ReagentⅢ：临用前配制；48 T加入 0.75 mL去离子水，96 T加入 1.5 mL去离子水，充分溶解待用。用不完的试剂 4℃避光可保存一个月。

ReagentⅣ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

样本制备

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 20 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 3 min（功率 300 W，超声 3 s，间隔 7 s，总时间 3 min），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中进行）：

充分混匀，于 340 nm处测定初始吸光值 A1与 30 min后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每mg蛋白每分钟催化生成 1 nmol NADH的酶量为 1个酶活单位。

（2）按样本质量计算:

酶活定义：每 g样品每分钟催化生成 1 nmol NADH的酶量为 1个酶活单位。

（3）按照细胞数量计算:

酶活定义：每 104个细胞每分钟催化生成 1 nmol NADH的酶量为 1个酶活单位。

（4）按液体体积计算:

酶活定义：每mL样本每分钟催化生成 1 nmol NADH的酶量为 1个酶活单位。

ε：NADH 微摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，0.2 mL；V 样：反应体系中样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30 min；500：细胞总数，5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。

注意事项

1. Reagent IV 有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。